Abstract Autoinhibition is an important regulatory mechanism for cytoskeletal motor proteins. Kinesin-1 (kinesin hereafter), the ubiquitous plus-end directed microtubule motor, is thought to be controlled by a complicated autoinihibition mechanism, but the molecular details remain unclear. Conformational changes mediated by intramolecular interactions between the C-terminal tail and N-terminal motor domains of the kinesin heavy chain (KHC) are proposed to be one facet of motor regulation. The dimeric KHC also binds two copies of the kinesin light chains (KLCs), which have been implicated in both autoinhibition and cargo-dependent activation of the tetrameric motor complex, although the precise mechanisms remain opaque. Using in vitro reconstitution, we show that the KLC strongly inhibits the kinesin-microtubule interaction via an independent mechanism from the tail-motor interaction within KHC. Kinesin cargo-adaptor proteins that bind KLC activated processive movement of the kinesin tetramer but the landing rate of these activated complexes remained low. The addition of MAP7, which specifically binds to the KHC, strongly enhanced activated motor motility by dramatically increasing the landing rate and processivity of the activated kinesin motors. Our results support a model whereby the activity of the kinesin tetramer is regulated by independent tail- and KLC-based inhibition mechanisms, and that cargo-adaptor binding to the KLC directly releases both of these inhibitions. However, we find that a third component, a non-motor MAP is required for robust activity of the activated motor. Thus, human kinesin activity is regulated by a two-factor mechanism comprised of intramolecular allosteric regulation, as well as intermolecular kinesin-adaptor and kinesin-MAP interactions.

Abstract Microtubules are dynamic polymers consisting of αβ-tubulin heterodimers. The initial polymerization process, called microtubule nucleation, occurs spontaneously via αβ-tubulin. Since a large energy barrier prevents microtubule nucleation in cells, the γ-tubulin ring complex is recruited to the centrosome to overcome the nucleation barrier. However, detachment of a considerable number of microtubules from the centrosome is known to contribute to fundamental processes in cells. Here, we present evidence that minus-end-binding calmodulin-regulated spectrin-associated protein 2 (CAMSAP2) serves as a strong nucleator for microtubule formation from soluble αβ-tubulin independent of γ-tubulin. CAMSAP2 significantly reduces the nucleation barrier close to the critical concentration for microtubule polymerization by stabilizing the longitudinal contacts among αβ-tubulins. CAMSAP2 clusters together with αβ-tubulin to generate nucleation intermediates, from which numerous microtubules radiate, forming aster-like structures. Our findings suggest that CAMSAP2 supports microtubule growth by organizing a nucleation centre as well as by stabilizing microtubule nucleation intermediates.

ABSTRACT Extreme-value analysis (EVA) deals with deviations in the data from the median of the probability distributions. EVA serves various purposes such as predicting disasters and analyzing sports records. Herein, we extended the use of EVA to investigate the motility functions of nanoscale motor proteins in neurons of the living worm Caenorhabditis elegans ( C. elegans ). Motor proteins, such as kinesin and dynein, move along microtubules anterogradely and retrogradely, respectively, to deliver the cargo-containing materials needed for the cells. Although the essential difference between the two motors could not be inferred from the mean velocity values, the return-level EVA plots obtained from the velocity data revealed a difference. Shape parameters of the generalized extreme value distribution of EVA ξ < 0 for anterograde transport and ξ ≥ 0 for retrograde transport. Our findings extend the possibility and applicability of EVA for analyzing motility data of nanoscale proteins in vivo .

Abstract KIF1A is a kinesin-family motor involved in the axonal transport of synaptic vesicle precursors (SVPs) along microtubules. In humans, more than ten point mutations in KIF1A are associated with the motor neuron disease, hereditary spastic paraplegia (SPG). However, not all of these mutations appear to inhibit the motility of the KIF1A motor, and thus, a clear molecular explanation for how KIF1A mutations lead to neuropathy is not available. In this study, we established in vitro motility assays with purified full-length human KIF1A and found that KIF1A mutations associated with the pure form of spastic paraplegia hyperactivate motility of the KIF1A motor. Introduction of the corresponding mutations into Caenorhabditis elegans KIF1A homologue unc-104 revealed abnormal accumulation of SVPs at the tips of axons and increased anterograde axonal transport of SVPs. Our data reveal that hyper-activation of kinesin motor activity, rather than its loss-of-function, is a novel cause of motor neuron disease in humans. Significance Statement Anterograde axonal transport supplies organelles and protein complexes throughout axonal processes to support neuronal morphology and function. It has been observed that reduced anterograde axonal transport is associated with neuronal diseases. In contrast, here we show that particular disease-associated mutations in KIF1A, an anterograde axonal motor for synaptic vesicle precursors, induce hyperactivation of KIF1A motor activity and increased axonal transport of synaptic vesicle precursors. Our results advance the knowledge of the regulation of motor proteins and axonal transport and cell biology of motor neuron diseases.

Abstract KIF1A is a kinesin superfamily molecular motor that transports synaptic vesicle precursors in axons. Mutations in Kif1a lead to a group of neuronal diseases called KIF1A-associated neuronal disorder (KAND). KIF1A forms a homodimer and KAND mutations are mostly de novo and autosomal dominant; however, it is not known whether the function of wild-type KIF1A is inhibited by disease-associated KIF1A when they are dimerized. No reliable in vivo model systems to analyze the molecular and cellular biology of KAND caused by loss of function mutations have been developed; therefore, here, we established Caenorhabditis elegans models for KAND using CRISPR/cas9 technology and analyzed defects in axonal transport. In the C. elegans models, heterozygotes and homozygotes exhibited reduced axonal transport phenotypes. Suppressor screening using the disease model worm identified a mutation that recovers the motor activity of disease-associated human KIF1A. In addition, we developed in vitro assays to analyze the motility of single heterodimers composed of wild-type KIF1A and disease-associated KIF1A. Disease-associated KIF1A significantly inhibited the motility of wild-type KIF1A when heterodimers were formed. These data indicate the molecular mechanism underlying the dominant nature of de novo KAND mutations. Significance Statement KIF1A is a molecular motor that transports synaptic vesicle precursors in axons. Recent studies have identified many KIF1A mutations in congenital neuropathy patients; however, the molecular mechanism of pathogenesis remains largely elusive. This study established loss of function models for KIF1A-associated neuronal disorder (KAND) in Caenorhabditis elegans to analyze the molecular and cell biology of the disease in vivo . Genetic screening using the disease model could find a mutation that recovers the motor activity of disease-associated KIF1A. This study also established in vitro single-molecule assays to quantitatively analyze the effect of KAND mutations when mutant KIF1A forms heterodimers with wild-type KIF1A. Our findings provide a foundation for future genetic screening and for drug screening to search for KAND treatments.

Abstract KIF5A is a kinesin superfamily motor protein that transports various cargos in neurons. Mutations in Kif5a cause familial amyotrophic lateral sclerosis (ALS). These ALS mutations are in the intron of Kif5a and induce mis-splicing of KIF5A mRNA, leading to splicing out of exon 27, which in human KIF5A encodes the cargo-binding tail domain of KIF5A. Therefore, it has been suggested that ALS is caused by loss of function of KIF5A. However, the precise mechanisms regarding how mutations in KIF5A cause ALS remain unclear. Here, we show that an ALS-associated mutant of KIF5A, KIF5A(Δexon27), is predisposed to form oligomers and aggregates in cultured mouse cell lines. Interestingly, purified KIF5A(Δexon27) oligomers showed more active movement on microtubules than wild type KIF5A in vitro . Purified KIF5A(Δexon27) was prone to form aggregates in vitro . Moreover, KIF5A(Δexon27)-expressing Caenorhabditis elegans neurons showed morphological defects. These data collectively suggest that ALS-associated mutations of KIF5A are toxic gain-of-function mutations rather than simple loss-of-function mutations.

Abstract KIF1A, a kinesin-3 family member, plays critical roles as a long-distance cargo-transporter within neurons. Over 100 known KIF1A mutations in humans result in KIF1A Associated Neurological Disease (KAND), developmental and degenerative neurological conditions for which there is no cure. A de novo missense mutation, P305L, was recently identified in several children diagnosed with KAND, but the underlying molecular basis for the disease phenotype is unknown. Interestingly, this residue is highly conserved in kinesin-family proteins, and together with adjacent conserved residues also implicated in KAND, forms an unusual 3 10 -helical element immediately C-terminal to loop-12 (L12, also known as the K-loop in KIF1A) in the conserved kinesin motor core. In KIF1A, the disordered K-loop contains a highly charged insertion of lysines that is thought to endow the motor with a high microtubule-association rate. Here, we characterize the molecular defects of the P305L mutation in KIF1A using genetic, biochemical, and single-molecule approaches. We find the mutation negatively impacts the velocity, run-length, and force generation of the motor. However, a much more dramatic effect is observed on the microtubule-association rate of the motor, revealing that the presence of an intact K-loop is not sufficient for its function. We hypothesize that an elusive K-loop conformation, mediated by formation of a highly conserved adjacent 3 10 -helix that is modulated via P305, is critically important for the kinesin-microtubule interaction. Importantly, we find that the function of this proline is conserved in the canonical kinesin, KIF5, revealing a fundamental principle of the kinesin motor mechanism.

Abstract During prometaphase in mitosis, chromosomes are pushed toward the spindle equator. The chromokinesin Kid moves chromosomes along spindle microtubules during prometaphase. Kid has long been considered as a monomeric and non-processive motor, different from typical kinesins that use two motor domains to transport cargos. However, this notion raises a question about how Kid transports chromosomes along microtubules. In this study, we demonstrate that the full-length Kid forms a homodimer and moves processively along microtubules. Both human and Xenopus Kid move along microtubules approximately at 70 nm/sec. We found Kid movement is characterized by frequent diffusive motions during the processive movement. Both human and Xenopus Kid, in their full-length forms, are eluted in dimer fractions in the size exclusion chromatography analysis but mostly dissociated into monomers in mass photometry analysis. A conserved coiled-coil domain within the stalk region of Kid is not only capable of homodimer formation, but is also required for the processivity of Kid. Furthermore, the stalk domain of Kid could add processive activity to the motor domain of KIF1A, suggesting that the stalk domain of Kid contains a functional neck linker and dimerization capability, a prerequisite for the processivity of kinesin motor domains. These findings collectively suggest the reclassification of Kid as a processive motor that possesses unique features.

ABSTRACT KIF1A is a member of the kinesin-3 family motor protein that transports synaptic vesicle precursors in axons. Mutations in the Kif1a gene cause neuronal diseases. Most patients are heterozygous and have both mutated and intact KIF1A alleles, suggesting that heterodimers composed of wild-type KIF1A and mutant KIF1A are likely involved in pathogenesis. In this study, we propose mathematical models to describe the motility of KIF1A heterodimers composed of wild-type KIF1A and mutant KIF1A. Our models precisely describe run length, run time, and velocity of KIF1A heterodimers using a few parameters obtained from two homodimers. The independent head model is a simple hand-over-hand model in which stepping and detachment rates from a microtubule of each head are identical to those in the respective homodimers. Although the velocities of heterodimers expected from the independent head model were in good agreement with the experimental results, this model underestimated the run lengths and run times of some heterodimeric motors. To address this discrepancy, we propose the coordinated head model, in which we hypothesize a tethered head, in addition to a microtubule-binding head, contributes to microtubule binding in a vulnerable one-head-bound state. The run lengths and run times of the KIF1A heterodimers predicted by the coordinated head model matched well with experimental results, suggesting a possibility that the tethered head affects the microtubule binding of KIF1A. Our models provide insights into how each head contributes to the processive movement of KIF1A and can be used to estimate motile parameters of KIF1A heterodimers. SIGNIFICANCE KIF1A is responsible for transporting synaptic vesicle precursors in axons. KIF1A mutations are associated with neurodegener-ative diseases. Most of these mutations are de novo and autosomal dominant, suggesting that half of the motors in patients are heterodimers composed of wild-type and mutant KIF1A. However, reliable theoretical models to explain the behavior of heterodimeric motors are lacking. In this study, we obtained exact analytical solutions to describe run length, run time, and velocity of heterodimeric motors which move in a hand-over-hand fashion. Our models provide valuable tools for quantitatively understanding the impact of heterodimerization with mutant KIF1A and the cooperative behavior of KIF1A dimers.

Abstract KIF1A/UNC-104, a member of the kinesin super family motor proteins, plays a pivotal role in the axonal transport of synaptic vesicles and their precursors. Drosophila melanogaster UNC-104 (DmUNC-104) is a relatively recently discovered Drosophila kinesin. Although some point mutations that disrupt synapse formation have been identified, the biochemical properties of DmUNC-104 protein have not been investigated. Here, we prepared recombinant full-length DmUNC-104 protein and determined the biochemical features. We analyzed the effect of a previously identified missense mutation in the FHA domain, called bristly ( bris ), and found that wild-type DmUNC-104 is a mixture of monomer and dimer and the bris mutation strongly promote the dimerization. Furthermore, we found that disease-associated mutations also promote the dimerization of DmUNC-104. These findings suggest that the FHA domain is essential for the autoinhibition of KIF1A/UNC-104, and that abnormal dimerization of KIF1A is linked to human diseases.