Interferon-γ (IFN-γ) promotes a population of T-bet+ CXCR3+ regulatory T (Treg) cells that limit T helper 1 (Th1) cell-mediated pathology. Our studies demonstrate that interleukin-27 (IL-27) also promoted expression of T-bet and CXCR3 in Treg cells. During infection with Toxoplasma gondii, a similar population emerged that limited T cell responses and was dependent on IFN-γ in the periphery but on IL-27 at mucosal sites. Transfer of Treg cells ameliorated the infection-induced pathology observed in Il27−/− mice, and this was dependent on their ability to produce IL-10. Microarray analysis revealed that Treg cells exposed to either IFN-γ or IL-27 have distinct transcriptional profiles. Thus, IFN-γ and IL-27 have different roles in Treg cell biology and IL-27 is a key cytokine that promotes the development of Treg cells specialized to control Th1 cell-mediated immunity at local sites of inflammation.

Apicomplexan parasites release factors via specialized secretory organelles (rhoptries, micronemes) that are thought to control host cell responses. In order to explore parasite-mediated modulation of host cell signaling pathways, we exploited a phylogenomic approach to characterize the Toxoplasma gondii kinome, defining a 44 member family of coccidian-specific secreted kinases, some of which have been previously implicated in virulence. Comparative genomic analysis suggests that "ROPK" genes are under positive selection, and expression profiling demonstrates that most are differentially expressed between strains and/or during differentiation. Integrating diverse genomic-scale analyses points to ROP38 as likely to be particularly important in parasite biology. Upregulating expression of this previously uncharacterized gene in transgenic parasites dramatically suppresses transcriptional responses in the infected cell. Specifically, parasite ROP38 downregulates host genes associated with MAPK signaling and the control of apoptosis and proliferation. These results highlight the value of integrative genomic approaches in prioritizing candidates for functional validation.

Abstract Cell death plays a critical role in inflammatory responses. During pyroptosis, inflammatory caspases cleave Gasdermin D (GSDMD) to release an N-terminal fragment that generates plasma membrane pores that mediate cell lysis and IL-1 cytokine release. Terminal cell lysis and IL-1β release following caspase activation can be uncoupled in certain cell types or in response to particular stimuli, a state termed hyperactivation. However, the factors and mechanisms that regulate terminal cell lysis downstream of GSDMD cleavage remain poorly understood. In the course of studies to define regulation of pyroptosis during Yersinia infection, we identified a line of Card19 -deficient mice ( Card19 lxcn ) whose macrophages were protected from cell lysis and showed reduced apoptosis and pyroptosis, yet had wild-type levels of caspase activation, IL-1 secretion, and GSDMD cleavage. Unexpectedly, CARD19, a mitochondrial CARD-containing protein, was not directly responsible for this, as two independently-generated CRISPR/Cas9 Card19 knockout mice showed no defect in macrophage cell lysis, and expression of CARD19 in Card19 lxcn macrophages did not restore cell lysis. Card19 is located on chromosome 13, adjacent to Ninj1 , which was recently reported to regulate cell lysis downstream of GSDMD activation. Intriguingly, RNA-seq and western blotting revealed that Card19 lxcn BMDMs are hypomorphic for NINJ1 expression, and reconstitution of Ninj1 in Card19 lxcn immortalized BMDMs restored cell lysis. Card19 lxcn mice exhibited significantly increased susceptibility to Yersinia infection, demonstrating that cell lysis itself plays a key role in protection against bacterial infection. Our findings identify genetic targeting of Card19 being responsible for off-target effects on the adjacent Ninj1 gene, thereby disrupting the ability of macrophages to undergo plasma membrane rupture downstream of gasdermin cleavage and impacting host survival and bacterial control during Yersinia infection. Author Summary Programmed cell death is critical for regulating tissue homeostasis and host defense against infection. Pyroptosis is an inflammatory form of programmed cell death that couples cell lysis with release of inflammatory cytokines. Cell lysis is triggered by activation of particular intracellular pore forming proteins, but how regulation of cell lysis occurs is not well understood. Genetic targeting of Card19 on chromosome 13 resulted in decreased expression of the adjacent gene, Ninj1 which was recently found to regulate terminal lysis events in response to cell death-inducing stimuli. We found that macrophages from Card19 -deficient mice were resistant to multiple forms of cell death in response to a variety of inflammatory stimuli, including canonical and non-canonical inflammasome activation, as well as triggers of cell-extrinsic apoptosis. Notably, Card19 -deficient mice were more susceptible to Yersinia infection, indicating that cell lysis contributes to control of bacterial infections. Our data provide new insight into the impact of terminal cell lysis on control of bacterial infection and highlight the role of additional factors that regulate lytic cell death downstream of gasdermin cleavage.

Abstract Background The maternal microbiome has emerged as an important factor in gestational health and outcome and is associated with risk of preterm birth and offspring morbidity. Epidemiological evidence also points to successive pregnancies – referred to as maternal parity – as a risk factor for preterm birth, infant mortality, and impaired neonatal growth. Despite the fact that both the maternal microbiome and parity are linked to maternal-infant health, the impact of parity on the microbiome remains largely unexplored, in part due to the challenges of studying parity in humans. Results Using synchronized pregnancies and dense longitudinal monitoring of the microbiome in pigs, we describe a microbiome trajectory during pregnancy and determine the extent to which parity modulates this trajectory. We show that the microbiome changes reproducibly during gestation and that this remodeling occurs more rapidly as parity increases. At the time of parturition, parity was linked to the relative abundance of several bacterial species, including Treponema bryantii, Lactobacillus amylovorus , and Lactobacillus reuteri . Strain tracking carried out in 18 maternal-offspring ‘quadrads’ – each consisting of one mother sow and three piglets – linked maternal parity to altered levels of Akkermansia muciniphila, Prevotella stercorea , and Campylobacter coli in the infant gut 10 days after birth. Conclusions Collectively, these results identify parity as an important environmental factor that modulates the gut microbiome during pregnancy and highlight the utility of a swine model for investigating the microbiome in maternal-infant health. In addition, our data show that the impact of parity extends beyond the mother and is associated with alterations in the community of bacteria that colonize the offspring gut early in life. The bacterial species we identified as parity-associated in the mother and offspring have been shown to influence host metabolism in other systems, raising the possibility that such changes may influence host nutrient acquisition or utilization. These findings, taken together with our observation that even subtle differences in parity are associated with microbiome changes, underscore the importance of considering parity in the design and analysis of human microbiome studies during pregnancy and in infants.

SUMMARY The intestinal parasite, Cryptosporidium , is a major contributor to global child mortality and causes opportunistic infection in immune deficient individuals. Innate resistance to Cryptosporidium , which specifically invades enterocytes, is dependent on the production of IFN-γ, yet whether enterocytes contribute to parasite control is poorly understood. In this study, utilizing the natural mouse pathogen, Cryptosporidium tyzzeri , we show that epithelial-derived IL-18 synergized with IL-12 to stimulate innate lymphoid cell (ILC) production of IFN-γ. This innate IFN-γ was required for early parasite control. Loss of STAT1 in enterocytes, but not dendritic cells or macrophages, antagonized early parasite control. Transcriptional profiling of enterocytes from infected mice identified an IFN-γ signature and enrichment of anti-microbial effectors like IDO, GBP and IRG. Deletion experiments identified a role for Irgm1/m3 in parasite control. Thus, enterocytes promote ILC production of IFN-γ that acts on enterocytes to restrict the growth of C. tyzzeri .

Abstract Cryptosporidium is a leading cause of severe diarrhea and diarrheal-related death in children worldwide. As an obligate intracellular parasite, Cryptosporidium relies on intestinal epithelial cells to provide a niche for its growth and survival, but little is known about the contributions that the infected cell makes to this relationship. Here we conducted a genome wide CRISPR/Cas9 knockout screen to discover host genes required for Cryptosporidium parvum infection and/or host cell survival. Gene enrichment analysis indicated that the host interferon response, glycosaminoglycan (GAG) and glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor biosynthesis are important determinants of susceptibility to C. parvum infection. Several of these pathways are linked to parasite attachment and invasion and C-type lectins on the surface of the parasite. Evaluation of transcript and protein induction of innate interferons revealed a pronounced type III interferon response to Cryptosporidium in human cells as well as in mice. Treatment of mice with IFNλ reduced infection burden and protected immunocompromised mice from severe outcomes including death, with effects that required STAT1 signaling in the enterocyte. Initiation of this type III interferon response was dependent on sustained intracellular growth and mediated by the pattern recognition receptor TLR3. We conclude that host cell intrinsic recognition of Cryptosporidium results in IFNλ production critical to early protection against this infection. Author Summary Cryptosporidium infection is an important contributor to global childhood mortality. There are currently no vaccines available, and the only drug has limited efficacy in immunocompromised individuals and malnourished children who need it most. To discover which host proteins are essential for Cryptosporidium infection, we conducted a genome wide knockout screen in human host cells. Our results confirm the importance of glycosaminoglycans on the surface of epithelial cells for attachment and invasion of the parasite. We also found that host GPI anchor biosynthesis and interferon signaling pathways were enriched by our screen. Examining the role of interferon signaling further we found a type III interferon response, IFNλ, was generated in response to infection and shown to be initiated in the infected cell. Utilizing mouse models of infection, we found that the type III interferon response was important early during infection with its induction likely preceding IFNγ, a key cytokine for the control of this infection. We also determined that TLR3 was the pattern recognition receptor responsible for IFNλ production during Cryptosporidium infection. Our work shows that IFNλ acts directly on the enterocyte and its use in treating immunocompromised mice produced striking reductions in infection.

Abstract Background Eukaryotes such as fungi and protists frequently accompany bacteria and archaea in microbial communities. Unfortunately, their presence is difficult to study with ‘shotgun’ metagenomic sequencing since prokaryotic signals dominate in most environments. Recent methods for eukaryotic detection use eukaryote-specific marker genes, but they do not incorporate strategies to handle the presence of eukaryotes that are not represented in the reference marker gene set, and they are not compatible with web-based tools for downstream analysis. Results Here we present CORRAL (for Clustering□Of□Related Reference ALignments), a tool for identification of eukaryotes in shotgun metagenomic data based on alignments to eukaryote-specific marker genes and Markov clustering. Using a combination of simulated datasets, mock community standards, and large publicly available human microbiome studies, we demonstrate that our method is not only sensitive and accurate but is also capable of inferring the presence of eukaryotes notincluded in the marker gene reference, such as novel strains. Finally, we deploy CORRAL on our MicrobiomeDB.org resource, producing an atlas of eukaryotes present in various environments of the human body and linking their presence to study covariates. Conclusions CORRAL allows eukaryotic detection to be automated and carried out at scale. Implementation of CORRAL in MicrobiomeDB.org creates a running atlas of microbial eukaryotes in metagenomic studies. Since our approach is independent of the reference used, it may be applicable to other contexts where shotgun metagenomic reads are matched against redundant but non-exhaustive databases, such as identification of bacterial virulence genes or taxonomic classification of viral reads.

Abstract Diarrheal disease, a major cause of morbidity and mortality in dairy calves, is strongly associated with the health and composition of the gut microbiome. Clostridioides difficile is an opportunistic pathogen that proliferates and can produce enterotoxins when the host experiences gut dysbiosis. However, even asymptomatic colonization with C. difficile can be associated with differing degrees of microbiome disruption in a range of species, including people, swine, and dogs. Little is known about the interaction between C. difficile and the gut microbiome in dairy calves. In this study, we sought to define microbial features associated with C. difficile colonization in pre-weaned dairy calves less than 2 weeks of age. We characterized the fecal microbiota of 80 calves from 23 different farms using 16S rRNA sequencing and compared the microbiota of C. difficile -positive (n=24) and C. difficile -negative calves (n=56). Farm appeared to be the greatest source of variability in the gut microbiota. When controlling for calf age, diet, and farm location, there was no significant difference in Shannon alpha diversity ( P = 0.50) or in weighted UniFrac beta diversity (P=0.19) between C. difficile -positive and –negative calves. However, there was a significant difference in beta diversity as assessed using Bray-Curtiss diversity ( P =0.0077), and C. difficile -positive calves had significantly increased levels of Ruminococcus (gnavus group) ( Adj. P =0.052) , Lachnoclostridium ( Adj. P =0.060) , Butyricicoccus ( Adj. P =0.060), and Clostridium sensu stricto 2 compared to C. difficile -negative calves. Additionally, C. difficile -positive calves had fewer microbial co-occurrences than C. difficile –negative calves, indicating reduced bacterial synergies. Thus, while C. difficile colonization alone is not associated with dysbiosis and is therefore unlikely to result in an increased likelihood of diarrhea in dairy calves, it may be associated with a more disrupted microbiota.

Enteric parasitic infections are among the most prevalent infections in lower- and middle-income countries (LMICs), and have a profound impact on global public health. While the microbiome is increasingly recognized as a key determinant of gut health and human development, the impact of naturally-acquired parasite infections on microbial community structure in the gut, and the extent to which parasite-induced changes in the microbiome may contribute to gastrointestinal symptoms, is poorly understood. Enteric parasites are routinely identified in companion animals in the United States, presenting a unique opportunity to leverage this animal model to investigate the impact of naturally-acquired parasite infections on the microbiome. Clinical, parasitological, and microbiome profiling of a cohort of 258 dogs revealed a significant correlation between parasite infection and composition of the bacterial community in the gut. Relative to other enteric pathogens, Giardia was associated with a more pronounced perturbation of the microbiome. Using a database mining approach that allowed us to compare our findings to a large-scale epidemiological study of enteric diseases in humans, we also observed a substantial alteration to microbiome structure in Giardia-infected children. Importantly, infection was associated with a reduction in the relative abundance of potential pathobionts, including Gammaproteobacteria, and an increase in Prevotella - a profile often associated with gut health. Taken together, our data show that widespread Giardia infection in young animals and humans is associated with significant remodeling of the gut microbiome, and provide a possible explanation for the high prevalence of asymptomatic Giardia infections observed across host species.