Omega-3 fatty acids (ω-3 FAs), DHA and EPA, exert anti-inflammatory effects, but the mechanisms are poorly understood. Here, we show that the G protein-coupled receptor 120 (GPR120) functions as an ω-3 FA receptor/sensor. Stimulation of GPR120 with ω-3 FAs or a chemical agonist causes broad anti-inflammatory effects in monocytic RAW 264.7 cells and in primary intraperitoneal macrophages. All of these effects are abrogated by GPR120 knockdown. Since chronic macrophage-mediated tissue inflammation is a key mechanism for insulin resistance in obesity, we fed obese WT and GPR120 knockout mice a high-fat diet with or without ω-3 FA supplementation. The ω-3 FA treatment inhibited inflammation and enhanced systemic insulin sensitivity in WT mice, but was without effect in GPR120 knockout mice. In conclusion, GPR120 is a functional ω-3 FA receptor/sensor and mediates potent insulin sensitizing and antidiabetic effects in vivo by repressing macrophage-induced tissue inflammation.PaperFlickeyJraWQiOiI4ZjUxYWNhY2IzYjhiNjNlNzFlYmIzYWFmYTU5NmZmYyIsImFsZyI6IlJTMjU2In0.eyJzdWIiOiIxNGY4MmQ3OWU4NmEzZjc3ZDMyZjAwYzMzYTIzYmQ3MiIsImtpZCI6IjhmNTFhY2FjYjNiOGI2M2U3MWViYjNhYWZhNTk2ZmZjIiwiZXhwIjoxNjM0NzY2MTkxfQ.UE6baFwXuukypS1o5hhDSdlpopIMlPZTcZBGXHyjS15SY-e-a6n2CZK-LiUICjDKdyABOaO9v17RusVjlKy_NKz6MJHTFtOWAyNNCD87XXAB_1jMmc1O-irflCUbD9rR4HDkzaHldgiB-CWx0l54Sj_ClRlYaSINocJoCQiw-cC0CRpc0haHS9DUBCNTFgteuPd5ubf_qU-KfzI-anSgkoI3bQRQpbRjkuOGALG3wFzsL6tXAnJMp_1paPLNXaP1FTHcY3_CdDu2eeAuQT8b5jhz4py_YTJGDeDVsUhZh0iyUxZmoY901AVd4ayAkG5lgUO0N07Jyit9jt0FCk9wjg(mp4, (20.36 MB) Download video

SIRT1, an NAD+-dependent deacetylase that acts on proteins involved in cellular regulation, has been implicated in longevity and as a mediator of the beneficial effects of calorie restriction. A new screening programme has identified a series of small-molecule SIRT1 activators that are structurally unlike, and 1,000-fold more potent than, resveratrol, the well-known SIRT1 activator found in red wine. These new compounds improve metabolic function in animal models of diabetes and obesity, suggesting that they may have therapeutic potential in type 2 diabetes and insulin resistance. This work describes the identification and characterization of novel small molecule activators of SIRT1, an NAD+-dependent deacetylase that mediates the beneficial effects of caloric restriction. These small molecules are structurally unrelated to, and much more potent than, resveratrol, and improve metabolic function in animal models of diabetes and obesity. Calorie restriction extends lifespan and produces a metabolic profile desirable for treating diseases of ageing such as type 2 diabetes1,2. SIRT1, an NAD+-dependent deacetylase, is a principal modulator of pathways downstream of calorie restriction that produce beneficial effects on glucose homeostasis and insulin sensitivity3,4,5,6,7,8,9. Resveratrol, a polyphenolic SIRT1 activator, mimics the anti-ageing effects of calorie restriction in lower organisms and in mice fed a high-fat diet ameliorates insulin resistance, increases mitochondrial content, and prolongs survival10,11,12,13,14. Here we describe the identification and characterization of small molecule activators of SIRT1 that are structurally unrelated to, and 1,000-fold more potent than, resveratrol. These compounds bind to the SIRT1 enzyme–peptide substrate complex at an allosteric site amino-terminal to the catalytic domain and lower the Michaelis constant for acetylated substrates. In diet-induced obese and genetically obese mice, these compounds improve insulin sensitivity, lower plasma glucose, and increase mitochondrial capacity. In Zucker fa/fa rats, hyperinsulinaemic-euglycaemic clamp studies demonstrate that SIRT1 activators improve whole-body glucose homeostasis and insulin sensitivity in adipose tissue, skeletal muscle and liver. Thus, SIRT1 activation is a promising new therapeutic approach for treating diseases of ageing such as type 2 diabetes.

Adiponectin is an adipocyte-specific secretory protein that circulates in serum as a hexamer of relatively low molecular weight (LMW) and a larger multimeric structure of high molecular weight (HMW). Serum levels of the protein correlate with systemic insulin sensitivity. The full-length protein affects hepatic gluconeogenesis through improved insulin sensitivity, and a proteolytic fragment of adiponectin stimulates β oxidation in muscle. Here, we show that the ratio, and not the absolute amounts, between these two oligomeric forms (HMW to LMW) is critical in determining insulin sensitivity. We define a new index, SA, that can be calculated as the ratio of HMW/(HMW + LMW). db/db mice, despite similar total adiponectin levels, display decreased SA values compared with wild type littermates, as do type II diabetic patients compared with insulin-sensitive individuals. Furthermore, SA improves with peroxisome proliferator-activated receptor-γ agonist treatment (thiazolidinedione; TZD) in mice and humans. We demonstrate that changes in SA in a number of type 2 diabetic cohorts serve as a quantitative indicator of improvements in insulin sensitivity obtained during TZD treatment, whereas changes in total serum adiponectin levels do not correlate well at the individual level. Acute alterations in SA (ΔSA) are strongly correlated with improvements in hepatic insulin sensitivity and are less relevant as an indicator of improved muscle insulin sensitivity in response to TZD treatment, further underscoring the conclusions from previous clamp studies that suggested that the liver is the primary site of action for the full-length protein. These observations suggest that the HMW adiponectin complex is the active form of this protein, which we directly demonstrate in vivo by its ability to depress serum glucose levels in a dose-dependent manner. Adiponectin is an adipocyte-specific secretory protein that circulates in serum as a hexamer of relatively low molecular weight (LMW) and a larger multimeric structure of high molecular weight (HMW). Serum levels of the protein correlate with systemic insulin sensitivity. The full-length protein affects hepatic gluconeogenesis through improved insulin sensitivity, and a proteolytic fragment of adiponectin stimulates β oxidation in muscle. Here, we show that the ratio, and not the absolute amounts, between these two oligomeric forms (HMW to LMW) is critical in determining insulin sensitivity. We define a new index, SA, that can be calculated as the ratio of HMW/(HMW + LMW). db/db mice, despite similar total adiponectin levels, display decreased SA values compared with wild type littermates, as do type II diabetic patients compared with insulin-sensitive individuals. Furthermore, SA improves with peroxisome proliferator-activated receptor-γ agonist treatment (thiazolidinedione; TZD) in mice and humans. We demonstrate that changes in SA in a number of type 2 diabetic cohorts serve as a quantitative indicator of improvements in insulin sensitivity obtained during TZD treatment, whereas changes in total serum adiponectin levels do not correlate well at the individual level. Acute alterations in SA (ΔSA) are strongly correlated with improvements in hepatic insulin sensitivity and are less relevant as an indicator of improved muscle insulin sensitivity in response to TZD treatment, further underscoring the conclusions from previous clamp studies that suggested that the liver is the primary site of action for the full-length protein. These observations suggest that the HMW adiponectin complex is the active form of this protein, which we directly demonstrate in vivo by its ability to depress serum glucose levels in a dose-dependent manner. Adipocytes, beyond their role in lipid storage, can influence whole-body metabolism through modulation of systemic free fatty acid levels as well as secretion of cell-specific proteins collectively known as adipokines. Recent work has underscored the importance of these adipocyte-secreted molecules in energy homeostasis and metabolism (1Zhang Y. Proenca R. Maffel M. Barone M. Leopold L. Friedman J.M. Nature. 1994; 372: 425-432Crossref PubMed Scopus (11631) Google Scholar, 2Berg A.H. Combs T. Du X. Brownlee M. Scherer P.E. Nat. Med. 2001; 7: 947-953Crossref PubMed Scopus (2188) Google Scholar, 3Steppan C.M. Bailey S.T. Bhat S. Brown E.J. Banerjee R.R. Wright C.M. Patel H.R. Ahima R.S. Lazar M.A. Nature. 2001; 409: 307-312Crossref PubMed Scopus (3914) Google Scholar). Some of these adipokines have synergistic effects, whereas others, such as resistin and adiponectin/Acrp30 (adipocyte complement-related protein of 30 kDa), have competing effects; pharmacological doses of resistin deactivate the repressive effects of insulin on gluconeogenesis (4Rajala M.W. Obici S. Scherer P.E. Rossetti L. J. Clin. Invest. 2003; 111: 225-230Crossref PubMed Scopus (483) Google Scholar), whereas adiponectin increases insulin sensitivity, leading to enhanced inhibition of hepatic glucose output (5Combs T.P. Berg A.H. Obici S. Scherer P.E. Rossetti L. J. Clin. Inv. 2001; 108: 1875-1881Crossref PubMed Scopus (785) Google Scholar). Genetic variability within the adiponectin gene leads to alteration of serum levels of the protein and predisposes carriers of specific polymorphisms to insulin resistance (reviewed in Ref. 6Vasseur F. Lepretre F. Lacquemant C. Froguel P. Curr. Diab. Rep. 2003; 3: 151-158Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar). Decreased serum adiponectin is now considered a feature of obesity, and levels correlate with lowered indices of insulin sensitivity (7Weyer C. Funahashi T. Tanaka S. Hotta K. Matsuzawa Y. Pratley R.E. Tataranni P.A. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2001; 86: 1930-1935Crossref PubMed Scopus (2631) Google Scholar, 8Cnop M. Havel P.J. Utzschneider K.M. Carr D.B. Sinha M.K. Boyko E.J. Retzlaff B.M. Knopp R.H. Brunzell J.D. Kahn S.E. Diabetologia. 2003; 46: 459-469Crossref PubMed Scopus (1177) Google Scholar), leading to the hypothesis that decreased serum adiponectin levels are contributory and not simply diagnostic of systemic insulin resistance.The potential importance of adiponectin as a therapeutic target is underscored by the dramatic up-regulation of this adipokine in response to treatment with the antidiabetic, insulin-sensitizing agents known as thiazolidinediones (TZDs) 1The abbreviations used are: TZD, thiazolidinedione; LMW, low molecular weight form; HMW, high molecular weight form; PPARγ, peroxisome proliferator-activated receptor-γ; BMI, body mass index. 1The abbreviations used are: TZD, thiazolidinedione; LMW, low molecular weight form; HMW, high molecular weight form; PPARγ, peroxisome proliferator-activated receptor-γ; BMI, body mass index. (9Combs T.P. Wagner J.A. Berger J. Doebber T. Wang W.-J. Zhang B.B. Tanen M. Berg A.H. O'Rahilly S. Savage D.S. Chatterjee K. Weiss S. Larson P.J. Gottesdiener K.M. Gertz B.G. Charron M.J. Scherer P.E. Moller D.E. Endocrinology. 2002; 143: 998-1007Crossref PubMed Scopus (508) Google Scholar, 10Yu J.G. Javorschi S. Hevener A.L. Kruszynska Y.T. Norman R.A. Sinha M. Olefsky J.M. Diabetes. 2002; 51: 2968-2974Crossref PubMed Scopus (648) Google Scholar, 11Maeda N. Takahashi M. Funahashi T. Kihara S. Nishizawa H. Kishida K. Nagaretani H. Matsuda M. Komuro R. Ouchi N. Kuriyama H. Hotta K. Nakamura T. Shimomura I. Matsuzawa Y. Diabetes. 2001; 50: 2094-2099Crossref PubMed Scopus (1496) Google Scholar). TZDs have proven to be active in animal models of genetic or acquired insulin resistance as well as in type 2 diabetic patients in clinical settings, suggesting that these drugs improve insulin sensitivity regardless of the underlying cause (12Day C. Diabet. Med. 1999; 16: 179-192Crossref PubMed Scopus (399) Google Scholar). However, the molecular mechanisms of TZD action are still not fully understood. The presumptive target of TZDs, peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPARγ), is predominantly expressed in adipose tissue, suggesting that adipocytes may play a critical role in mediating the antidiabetic effects of these drugs (13Lehmann J.M. Moore L.B. Smith-Oliver T.A. Wilkison W.O. Willson T.M. Kliewer S.A. J. Biol. Chem. 1995; 270: 12953-12956Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3443) Google Scholar). This hypothesis has been supported by studies of “fatless” mice that displayed reduced metabolic improvement in response to TZD treatment (14Chao L. Marcus-Samuels B. Mason M.M. Moitra J. Vinson C. Arioglu E. Gavrilova O. Reitman M.L. J. Clin. Invest. 2000; 106: 1221-1228Crossref PubMed Scopus (335) Google Scholar). Subsequent studies in this same mouse model demonstrated amelioration of defects in insulin-stimulated glucose uptake in muscle with TZD administration but exacerbation of hepatic insulin resistance in these animals, leading to no significant net antidiabetic effect (15Kim J.K. Fillmore J.J. Gavrilova O. Chao L. Higashimori T. Choi H. Kim H.J. Yu C. Chen Y. Qu X. Haluzik M. Reitman M.L. Shulman G.I. Diabetes. 2003; 52: 1311-1318Crossref PubMed Scopus (82) Google Scholar).A number of studies have demonstrated that in mice and humans, TZD treatment effects transcriptional up-regulation accompanied by increased production and secretion of adiponectin from adipocytes (9Combs T.P. Wagner J.A. Berger J. Doebber T. Wang W.-J. Zhang B.B. Tanen M. Berg A.H. O'Rahilly S. Savage D.S. Chatterjee K. Weiss S. Larson P.J. Gottesdiener K.M. Gertz B.G. Charron M.J. Scherer P.E. Moller D.E. Endocrinology. 2002; 143: 998-1007Crossref PubMed Scopus (508) Google Scholar, 10Yu J.G. Javorschi S. Hevener A.L. Kruszynska Y.T. Norman R.A. Sinha M. Olefsky J.M. Diabetes. 2002; 51: 2968-2974Crossref PubMed Scopus (648) Google Scholar, 11Maeda N. Takahashi M. Funahashi T. Kihara S. Nishizawa H. Kishida K. Nagaretani H. Matsuda M. Komuro R. Ouchi N. Kuriyama H. Hotta K. Nakamura T. Shimomura I. Matsuzawa Y. Diabetes. 2001; 50: 2094-2099Crossref PubMed Scopus (1496) Google Scholar). However, whether the TZD-mediated induction of adiponectin is causative or simply diagnostic of improved insulin sensitivity remains under debate, since discordance between improvements in insulin sensitivity and induction in serum adiponectin levels has been reported (10Yu J.G. Javorschi S. Hevener A.L. Kruszynska Y.T. Norman R.A. Sinha M. Olefsky J.M. Diabetes. 2002; 51: 2968-2974Crossref PubMed Scopus (648) Google Scholar). Although the vast majority of patients induce adiponectin expression and secretion in response to TZD treatment, only 50–70% of patients demonstrate clinically improved insulin sensitivity (reviewed in Ref. 16Olefsky J.M. J. Clin. Invest. 2000; 106: 467-472Crossref PubMed Scopus (504) Google Scholar). This suggests that induction of adiponectin in any particular individual is neither predictive nor correlative to quantitative improvements in insulin sensitivity and led us to hypothesize that increased adiponectin levels alone are insufficient to explain the wide range of clinical responses to TZD treatment. We have recently demonstrated that adiponectin exists in minimally two forms in serum, as a hexamers referred to as a low molecular weight (LMW) complex and as a high molecular weight (HMW) complex consisting of 12–18 subunits (17Pajvani U.B. Du X. Combs T.P. Berg A.H. Rajala M.W. Schulthess T. Engel J. Brownlee M. Scherer P.E. J. Biol. Chem. 2003; 278: 9073-9085Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (928) Google Scholar). Here, we show that the ratio between these two oligomeric forms (HMW to LMW), not absolute amounts of circulating adiponectin, is critical in determining TZD-mediated improvements in insulin sensitivity.MATERIALS AND METHODSVelocity Sedimentation/Gel Filtration Chromatography for Separation of Adiponectin Complexes5–20% sucrose gradients in 10 mm HEPES, pH 8, 125 mm NaCl were poured stepwise in 2-ml thin walled ultracentrifuge tubes (Becton Dickinson) and allowed to equilibrate overnight at 4 °C. Following layering of the sample on top (diluted 1:10 with 10 mm HEPES, pH 8, 125 mm NaCl), gradients were spun at 55,000 rpm for 4 h at 4 °C in a TLS55 rotor in a Beckman TL-100 tabletop ultracentrifuge. 150-μl gradient fractions were sequentially retrieved and analyzed by quantitative Western blot analysis as described below. Adiponectin complex distribution was independently confirmed by gel filtration chromatography, as previously described (17Pajvani U.B. Du X. Combs T.P. Berg A.H. Rajala M.W. Schulthess T. Engel J. Brownlee M. Scherer P.E. J. Biol. Chem. 2003; 278: 9073-9085Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (928) Google Scholar).ImmunoblottingSeparation of proteins by SDS-PAGE and immunoblotting were performed as described previously (18Scherer P.E. Lisanti M.P. Baldini G. Sargiacomo M. Corley-Mastick C. Lodish H.F. J. Cell Biol. 1994; 127: 1233-1243Crossref PubMed Scopus (352) Google Scholar). Primary and secondary antibodies were diluted in TBS with 0.05% Tween 20 (TBS-T) and 1% bovine serum albumin. Horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies were detected with enhanced chemiluminescence according to the manufacturer's instructions (Pierce). For quantitative Western blotting, proteins were transferred to BA83 nitrocellulose (Schleicher & Schuell), and membranes were blocked with 5% nonfat dry milk (in TBS-T). An affinity-purified rabbit anti-adiponectin antibody raised against a peptide comprising the N-terminal hypervariable region (EDDVTTTEELAPALV, mouse; DQETTTQGPGV, human) was used; these antibodies recognize a single band of 30 kDa by Western analysis and have equal affinity for all oligomeric forms of the protein. Blots were decorated with an 125I-derivatized secondary goat anti-rabbit antibody (Amersham Biosciences) and analyzed with a PhosphorImager (Amersham Biosciences). Fractions 4–6 (hexamers) and 9–11 (HMW adiponectin) from velocity sedimentation were quantitated with ImageQuant software.In Vivo Animal StudiesMale db/db mice and control mice (db/+; Jackson Laboratories) were housed at 5 mice/cage and allowed ad libitum access to ground Purina rodent chow 5001 and water. The animals were dosed daily by gavage with vehicle (0.25% carboxymethylcellulose) with or without 10 mg/kg per day of rosiglitazone for 11 days or 10 mg/kg per day of PPARα agonist for 7 days (compound 10, an O-arylmandelic acid derivative (trifluromethyl benzisoxazole) (19Adams A.D. Hu Z. von Langen D. Dadiz A. Elbrecht A. MacNaul K.L. Berger J.P. Zhou G. Doebber T.W. Meurer R. Forrest M.J. Moller D.E. Jones A.B. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003; 13: 3185-3190Crossref PubMed Scopus (27) Google Scholar)). Plasma adiponectin, glucose, insulin, and triglyceride levels were determined from blood obtained by tail bleeds at 3–4-day intervals during the studies. Wild type animals (C57/Bl6J) used in adipose extraction and adiponectin knockout animals for in vivo adiponectin activity studies were maintained in the same manner. All animal protocols were approved by the Albert Einstein Animal Committee.Human Clinical Study ProtocolsStudy A—This was a single center, double-blind, randomized, placebo-controlled, parallel group study with treatments including placebo and rosiglitazone (4 mg twice daily) for 14 days. Twenty nondiabetic males were treated in this analysis (n = 10/group). Plasma for adiponectin concentration determination was obtained predose on day 1 (base line) and 2 h after the last dose on day 14. These subjects refrained from all other medication use from 14 days prior to completion of the trial and demonstrated no evidence or family history of diabetes mellitus. All subjects gave written informed consent, and the clinical protocol was approved by Commissie voor Medische Ethiek (Antwerp, Belgium).Study B—The study group consisted of 18 middle-aged type 2 diabetic patients treated with either diet or sulfonylureas, the latter being withdrawn for 4 weeks prior to entry into the treatment phase of the study. The treatment phase consisted of daily administration of troglitazone at a dose of 200–800 mg/day for 12 weeks as previously reported (20Prigeon R.L. Kahn S.E. Porte Jr., D. J. Clin. Endocrinol. Metab. 1998; 83: 819-823Crossref PubMed Scopus (78) Google Scholar). The data reported here are from the 13 individuals who underwent a frequently sampled intravenous glucose tolerance test to measure insulin sensitivity (SI calculated by minimal model analysis) before and after troglitazone treatment. The protocol was approved by the human subjects review committee of the University of Washington, and informed consent was obtained from all subjects.Study C—Hispanic women with a history of gestational diabetes mellitus were recruited to the Troglitazone in Prevention of Diabetes study if they had a sum of five glucose values on a 75-g oral glucose tolerance test that was above the median for a large cohort of women with gestational diabetes mellitus. Subjects underwent a frequently sampled intravenous glucose tolerance test to measure insulin sensitivity (SI, calculated by minimal model analysis) prior to enrollment and then again following 3 months of troglitazone treatment (400 mg/day). 108 women had measurements of insulin sensitivity at base line and three months post-treatment; plasma was obtained after overnight fasts from women who demonstrated >80% drug compliance (as measured by pill counts) and whose changes in insulin sensitivity between base line and 3 months was either the lowest (n = 20) or the highest (n = 20) in the cohort. At base line, the groups had similar oral glucose tolerance test glucose sum (736 ± 15 versus 765 ± 15 mg/dl). SI in women defined as low responders went from 3.3 ± 0.4 × 10–4 at base line to 3.8 ± 0.4 × 10–4 min–1 per microunit/ml after 3 months of troglitazone treatment. In the high responders, SI went from 2.7 ± 0.3 × 10–4 at base line to 5.1 ± 0.7 × 10–4 min–1 per microunit/ml at 3 months. All subjects gave consent for participation in the study, which was approved by the institutional review board of the University of Southern California.Study D—Ten subjects with type 2 diabetes and 17 nondiabetic control subjects (8 lean (BMI < 27 kg/m2) and 9 obese (BMI > 27 kg/m2)) participated in the study. Subjects were excluded if they had active cardiac, hepatic, or renal disease or if they had long term complications from diabetes. The diabetic subjects were asked to discontinue taking their medications at least 2 weeks before their base-line studies. Each subject underwent a hyperinsulinemic-euglycemic glucose clamp at base line and again after 3 months of treatment with 600 mg/day troglitazone. Following a 10-h overnight fast, a catheter was inserted in an antecubital vein, and a constant infusion was started of [3-3H]glucose (0.25 μCi/min) (PerkinElmer Life Sciences). At 0700 h, another catheter was inserted in a retrograde fashion in a hand vein, and at ∼0800 h, four basal blood samples were drawn for measurement of plasma glucose concentration and specific activity of insulin. Intravenous insulin infusion (Humulin; Lilly) diluted in 0.15 mol/liter saline containing 1% (w/v) human albumin was then begun at a rate of 80 milliunits·m–2·min–1. Blood samples were obtained every 5 min with a glucose analyzer (YSI 2700 analyzer; YSI, Yellow Springs, OH) for measurement of plasma glucose. A variable infusion of [3-3H]glucose-enriched 20% glucose was delivered to maintain a plasma glucose concentration of 5 mmol/liter. During the last 40 min of the insulin infusion, blood samples were obtained at 10-min intervals for determination of plasma glucose concentration and insulin. The study protocol was approved by the Human Subjects Committee of the University of California San Diego. This study was described in Ref. 10Yu J.G. Javorschi S. Hevener A.L. Kruszynska Y.T. Norman R.A. Sinha M. Olefsky J.M. Diabetes. 2002; 51: 2968-2974Crossref PubMed Scopus (648) Google Scholar.The critical parameters of the individual studies are summarized in Table I.Table IClinical characteristics of subjects examined in studies A-DStudyCohort examinedAverage age (range)Average BMI (range)Fasting glucoseFasting insulinTreatmentyearskg/m2± mg/dlmilliunits/literA20, nondiabetic males24 (18-42)24.4 ± 2.686 ± 7NDaND, not determined.Placebo88 ± 7Rosiglitazone, 4 mg twice daily (2-week treatment)B18, type 2 diabetic patients (14:4, male/female)66 (45-82)27 (20-38)180 ± 1415.3 ± 2.8Troglitazone 200-800 mg/day (12-weeks treatment)C20, female GDMbGDM, gestational diabetes mellitus. patients, responders35 (24-48)28 (21-40)94 ± 8NDTroglitazone 400 mg/day (12-weeks treatment)20, female GDM patients, nonresponders37 (30-50)29 (25-39)97 ± 7D10, type 2 diabetic patients (9:1, male/female)51 ± 333.6 ± 2.0178 ± 1420.6 ± 4.6Troglitazone 600 mg/day (12-weeks treatment)9, obese nondiabetic patients (8:1, male/female)45 ± 234.8 ± 1.280 ± 216.0 ± 2.78, lean (7:1, male/female)50 ± 224.3 ± 0.877 ± 24.3 ± 0.5a ND, not determined.b GDM, gestational diabetes mellitus. Open table in a new tab RESULTSDiabetic Mice Display Decreased HMW/Total Adiponectin Ratio Despite Comparable Levels of Total Serum Adiponectin—Whereas adiponectin levels are significantly reduced in states of decreased insulin sensitivity in humans under essentially all circumstances, insulin resistance in mice is often but not always associated with reduced adiponectin levels. This is particularly relevant for monogenic lesions such as the ones found in db/db and ob/ob mice. We have previously shown that db/db mice demonstrate comparable levels of circulating adiponectin as lean heterozygote littermates (9Combs T.P. Wagner J.A. Berger J. Doebber T. Wang W.-J. Zhang B.B. Tanen M. Berg A.H. O'Rahilly S. Savage D.S. Chatterjee K. Weiss S. Larson P.J. Gottesdiener K.M. Gertz B.G. Charron M.J. Scherer P.E. Moller D.E. Endocrinology. 2002; 143: 998-1007Crossref PubMed Scopus (508) Google Scholar). To determine whether differences between these animals could partially be explained on the basis of differential distribution of adiponectin complexes in serum, we analyzed serum from male db/db and db/+ mice by velocity sedimentation followed by SDS-PAGE (Fig. 1A). Similar to our previous findings, lean and obese animals had comparable total levels of adiponectin circulating in serum (Fig. 1B). However, db/db mice demonstrate a significantly decreased percentage of adiponectin in the HMW form (Fig. 1C). Similar reductions in percentage of HMW adiponectin can be seen in a number of other diabetic mouse models, including the ob/ob mouse (not shown).Thiazolidinedione Treatment Affects Circulating HMW/LMW Adiponectin Complex Ratios in Mice and Humans—TZD treatment leads to an induction of serum adiponectin and ameliorates the hyperglycemia, hypertriglyceridemia, and insulin resistance in the db/db mouse model within an 11-day course of treatment (9Combs T.P. Wagner J.A. Berger J. Doebber T. Wang W.-J. Zhang B.B. Tanen M. Berg A.H. O'Rahilly S. Savage D.S. Chatterjee K. Weiss S. Larson P.J. Gottesdiener K.M. Gertz B.G. Charron M.J. Scherer P.E. Moller D.E. Endocrinology. 2002; 143: 998-1007Crossref PubMed Scopus (508) Google Scholar). To determine whether TZD treatment affects the relative circulating concentrations of adiponectin oligomers in serum, a cohort of male db/db mice was treated with rosiglitazone, and adiponectin complexes were analyzed by velocity sedimentation. Prior to treatment, adiponectin is predominantly found in the LMW (hexameric) form of adiponectin, consistent with values from wild type male mice. However, following 11 days of rosiglitazone treatment, the percentage of adiponectin found in the HMW form nearly doubled, to ∼45% of total circulating adiponectin (Fig. 1D). Rosiglitazone treatment of ob/ob mice gave rise to similar induction in HMW adiponectin (not shown). Placebo treatment did not result in any significant change in adiponectin oligomeric distribution (not shown); nor did a 7-day treatment with PPARα agonist that was equally successful in reducing serum glucose, triglyceride, and insulin levels (by 45, 45, and 80%, respectively). This indicates that this shift in complex distribution can be attributed directly to TZD treatment and is not an indirect consequence of a systemic metabolic improvement (Fig. 1E).In order to see if this relative improvement in HMW adiponectin can also be observed in human subjects treated with TZDs, we initially tested the effects in a cohort of nondiabetic males (Study A (9Combs T.P. Wagner J.A. Berger J. Doebber T. Wang W.-J. Zhang B.B. Tanen M. Berg A.H. O'Rahilly S. Savage D.S. Chatterjee K. Weiss S. Larson P.J. Gottesdiener K.M. Gertz B.G. Charron M.J. Scherer P.E. Moller D.E. Endocrinology. 2002; 143: 998-1007Crossref PubMed Scopus (508) Google Scholar)). Since these were lean nondiabetic patients, no significant changes in fasting insulin or glucose were seen during the treatment period (2 weeks) with either rosiglitazone or placebo (not shown). Adiponectin complexes were analyzed in a double-blind fashion by velocity sedimentation before and after treatment (Fig. 2A). Only minor changes in total circulating adiponectin levels or in either adiponectin complex were seen in placebo-treated patients. Rosiglitazone-treated patients demonstrated significantly increased total adiponectin, primarily as a result of a dramatic increase in circulating HMW form (Fig. 2B). As a consequence, the HMW/total adiponectin ratio is significantly increased in rosiglitazone-treated individuals, with the post-treatment value reaching nearly 50% (Fig. 2C).Fig. 2TZD treatment induces HMW adiponectin in serum. Normal male volunteers were treated with either placebo (n = 10) or rosiglitazone (n = 10), and adiponectin complex formation was assessed by velocity sedimentation pre- and post-treatment. A, serum from representative patients receiving either vehicle (top two panels) or rosiglitazone (bottom two panels). B, induction in serum adiponectin (200% base-line levels), and oligomeric components, HMW adiponectin (365%), and hexameric (LMW) adiponectin (130%) with TZD treatment (black bars); no significant change was seen with vehicle treatment (white bars). C, resulting changes in the HMW/total adiponectin ratio. The asterisks indicate significant deviations from base-line measurements (p < 0.05).View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT)Improvement in Insulin Sensitivity Post-TZD Treatment Correlates with Increased HMW/Total Ratio, Not with Total Adiponectin Levels—To gain a better understanding of the functional relevance of the increased percentage of the HMW form in circulating adiponectin following thiazolidinedione treatment, we analyzed adiponectin complexes pre- and post-treatment in various cohorts of diabetic subjects. In one cohort, patients were treated with troglitazone for a period of 3 months (Study B (20Prigeon R.L. Kahn S.E. Porte Jr., D. J. Clin. Endocrinol. Metab. 1998; 83: 819-823Crossref PubMed Scopus (78) Google Scholar)), and insulin sensitivity (SI) was determined before and after treatment. Insulin sensitivity of the group as a whole increased. Nearly all (12 of 13) subjects demonstrated an increase in circulating adiponectin levels, ranging from 20 to 150% above base-line levels. There was no significant correlation between the increase in total adiponectin levels and the improvement in insulin sensitivity (Fig. 3A), consistent with previous reports in the literature that suggest that although most patients demonstrate an increase in circulating adiponectin levels post-TZD treatment, these increased levels in individual patients do not correspond to the magnitude of increase in insulin sensitivity (10Yu J.G. Javorschi S. Hevener A.L. Kruszynska Y.T. Norman R.A. Sinha M. Olefsky J.M. Diabetes. 2002; 51: 2968-2974Crossref PubMed Scopus (648) Google Scholar). In fact, in this particular cohort, approximately half of the patients demonstrated improvement in circulating levels of adiponectin by 25% or more without any significant change in insulin sensitivity. By contrast, there was good correlation between changes in insulin sensitivity and improvements in percentage of HMW/total adiponectin values (Fig. 3B). Similar to the trend observed in nondiabetic subjects, the absolute levels of HMW adiponectin increased in serum from most patients following thiazolidinedione treatment; however, there were type 2 diabetic patients who induced both total and HMW adiponectin levels to a similar degree and, thus, failed to improve their HMW/total ratio and demonstrated no improvement in insulin sensitivity. In order to not only account for absolute levels of HMW but to also take the total amount of adiponectin into consideration, we defined a new index (SA) reflecting the relative contribution of the HMW complex to circulating adiponectin levels (SA = HMW/total). SA rather than total adiponectin levels accounts for the patients in the cohort seen in Fig. 3A that do not demonstrate a quantifiable improvement in insulin sensitivity, and the very tight correlation observed underlines the emerging finding that the proportion of adiponectin in the HMW form rather than absolute circulating levels may play an important role in the amelioration in insulin resistance following treatment with TZDs.Fig. 3Change in HMW/total adiponectin ratio, but not in total adiponectin, correlates with improvements in insulin sensitivity post-troglitazone treatment in type 2 diabetic patients. Male, moderately obese (average BMI = 27.7 kg/m2) type 2 diabetic patients (n = 13) were treated with varying doses of troglitazone (200–800 mg/day), and improvements in insulin sensitivity (as measured by ΔSI) were assayed before and after 3 months of treatment. A, percentage change in serum adiponecti

Obesity and type 2 diabetes are characterized by decreased insulin sensitivity, elevated concentrations of free fatty acids (FFAs), and increased macrophage infiltration in adipose tissue (AT). Here, we show that FFAs can cause activation of RAW264.7 cells primarily via the JNK signaling cascade and that TLR2 and TLR4 are upstream of JNK and help transduce FFA proinflammatory signals. We also demonstrate that F4/80+CD11b+CD11c+ bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs) have heightened proinflammatory activity compared with F4/80+CD11b+CD11c− bone marrow-derived macrophages and that the proinflammatory activity and JNK phosphorylation of BMDCs, but not bone marrow-derived macrophages, was further increased by FFA treatment. F4/80+CD11b+CD11c+ cells were found in AT, and the proportion and number of these cells in AT is increased in ob/ob mice and by feeding wild type mice a high fat diet for 1 and 12 weeks. AT F4/80+CD11b+CD11c+ cells express increased inflammatory markers compared with F4/80+CD11b+CD11c− cells, and FFA treatment increased inflammatory responses in these cells. In addition, we found that CD11c expression is increased in skeletal muscle of high fat diet-fed mice and that conditioned medium from FFA-treated wild type BMDCs, but not TLR2/4 DKO BMDCs, can induce insulin resistance in L6 myotubes. Together our results show that FFAs can activate CD11c+ myeloid proinflammatory cells via TLR2/4 and JNK signaling pathways, thereby promoting inflammation and subsequent cellular insulin resistance. Obesity and type 2 diabetes are characterized by decreased insulin sensitivity, elevated concentrations of free fatty acids (FFAs), and increased macrophage infiltration in adipose tissue (AT). Here, we show that FFAs can cause activation of RAW264.7 cells primarily via the JNK signaling cascade and that TLR2 and TLR4 are upstream of JNK and help transduce FFA proinflammatory signals. We also demonstrate that F4/80+CD11b+CD11c+ bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs) have heightened proinflammatory activity compared with F4/80+CD11b+CD11c− bone marrow-derived macrophages and that the proinflammatory activity and JNK phosphorylation of BMDCs, but not bone marrow-derived macrophages, was further increased by FFA treatment. F4/80+CD11b+CD11c+ cells were found in AT, and the proportion and number of these cells in AT is increased in ob/ob mice and by feeding wild type mice a high fat diet for 1 and 12 weeks. AT F4/80+CD11b+CD11c+ cells express increased inflammatory markers compared with F4/80+CD11b+CD11c− cells, and FFA treatment increased inflammatory responses in these cells. In addition, we found that CD11c expression is increased in skeletal muscle of high fat diet-fed mice and that conditioned medium from FFA-treated wild type BMDCs, but not TLR2/4 DKO BMDCs, can induce insulin resistance in L6 myotubes. Together our results show that FFAs can activate CD11c+ myeloid proinflammatory cells via TLR2/4 and JNK signaling pathways, thereby promoting inflammation and subsequent cellular insulin resistance. Chronic inflammation is a well described feature of insulin resistance and obesity characterized by elevated proinflammatory JNK 2The abbreviations used are: JNK, c-Jun N-terminal kinase; FA, fatty acid; FFA, free fatty acid; TLR, Toll-like receptor; AT, adipose tissue; BM, bone marrow; BMDC, bone marrow-derived dendritic cell; BMDM, bone marrow-derived macrophage; HF, high fat; HFD, high fat diet; IL, interleukin; TNF, tumor necrosis factor; FBS, fetal bovine serum; BSA, bovine serum albumin; RT, reverse transcription; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; siRNA, small interfering RNA; WT, wild type; GM-CSF, granulocyte macrophage-colony-stimulating factor; FACS, fluorescence-activated cell sorter; PBS, phosphate-buffered saline; ITT, insulin tolerance test; SVF, stromal vascular fraction; SVC, stromal vascular cell; NC, normal chow; MNC, mononuclear cells; CM, conditioned medium; KD, knockdown; qPCR, quantitative PCR. and IKKβ kinase activity (1Yuan M. Konstantopoulos N. Lee J. Hansen L. Li Z.W. Karin M. Shoelson S.E. Science. 2001; 293: 1673-1677Crossref PubMed Scopus (1652) Google Scholar, 2Hirosumi J. Tuncman G. Chang L. Gorgun C.Z. Uysal K.T. Maeda K. Karin M. Hotamisligil G.S. Nature. 2002; 420: 333-336Crossref PubMed Scopus (2679) Google Scholar) and increased cyto/chemokine expression in insulin target tissues (3Dandona P. Aljada A. Bandyopadhyay A. Trends Immunol. 2004; 25: 4-7Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1672) Google Scholar). In white adipose tissue, chronic inflammation is associated with an increase in macrophage infiltration (4Weisberg S.P. McCann D. Desai M. Rosenbaum M. Leibel R.L. Ferrante Jr., A.W. J. Clin. Investig. 2003; 112: 1796-1808Crossref PubMed Scopus (7637) Google Scholar, 5Xu H. Barnes G.T. Yang Q. Tan G. Yang D. Chou C.J. Sole J. Nichols A. Ross J.S. Tartaglia L.A. Chen H. J. Clin. Investig. 2003; 112: 1821-1830Crossref PubMed Scopus (5275) Google Scholar, 6Bouloumie A. Curat C.A. Sengenes C. Lolmede K. Miranville A. Busse R. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. 2005; 8: 347-354Crossref PubMed Scopus (228) Google Scholar). Surgically induced weight loss (7Cancello R. Henegar C. Viguerie N. Taleb S. Poitou C. Rouault C. Coupaye M. Pelloux V. Hugol D. Bouillot J.L. Bouloumie A. Barbatelli G. Cinti S. Svensson P.A. Barsh G.S. Zucker J.D. Basdevant A. Langin D. Clement K. Diabetes. 2005; 54: 2277-2286Crossref PubMed Scopus (894) Google Scholar), diet and exercise (8Bruun J.M. Helge J.W. Richelsen B. Stallknecht B. Am. J. Physiol. 2006; 290: E961-E967Crossref PubMed Scopus (343) Google Scholar), and treatment with rosiglitazone, an insulin-sensitizing drug (5Xu H. Barnes G.T. Yang Q. Tan G. Yang D. Chou C.J. Sole J. Nichols A. Ross J.S. Tartaglia L.A. Chen H. J. Clin. Investig. 2003; 112: 1821-1830Crossref PubMed Scopus (5275) Google Scholar), all reduce macrophage infiltration in white adipose tissue (AT) and decrease the expression of proinflammatory markers in white AT and plasma. A definitive role for immune cells in metabolic dysregulation was recently demonstrated in mice with myeloid cell-specific knock-out of IKKβ (9Arkan M.C. Hevener A.L. Greten F.R. Maeda S. Li Z.W. Long J.M. Wynshaw-Boris A. Poli G. Olefsky J. Karin M. Nat. Med. 2005; 11: 191-198Crossref PubMed Scopus (1505) Google Scholar), indicating that macrophage activation can cause systemic insulin resistance. Macrophages are a heterogeneous population of phagocytic cells found throughout the body that originate from the mononuclear phagocytic system (10Mantovani A. Sica A. Locati M. Immunity. 2005; 23: 344-346Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (914) Google Scholar). These are highly plastic cells that arise from circulating myeloid-derived blood monocytes that have entered target tissues and gained the phenotypic and functional attributes of their tissue of residence. Like for other immune cells, the distribution and function of tissue macrophages have been largely characterized using monoclonal antibodies to cell surface proteins. In mice, the most commonly used monocyte/macrophage and myeloid cell surface markers are F4/80 and CD11b, although F4/80 and CD11b antibodies have been reported to react with eosinophils and dendritic cells and NK and other T and B cell subtypes, respectively (11Lai L. Alaverdi N. Maltais L. Morse H.C.R. J. Immunol. 1998; 160: 3861-3868PubMed Google Scholar). In AT, resident macrophages are surrounded by adipocytes that constantly release free fatty acids (FFAs) via lipolysis. FFAs thus have the potential to activate AT macrophages and consequently alter their function. FFAs can cause activation of JNK and IKKβ inflammatory pathways in adipose tissue, liver, and skeletal muscle (1Yuan M. Konstantopoulos N. Lee J. Hansen L. Li Z.W. Karin M. Shoelson S.E. Science. 2001; 293: 1673-1677Crossref PubMed Scopus (1652) Google Scholar, 2Hirosumi J. Tuncman G. Chang L. Gorgun C.Z. Uysal K.T. Maeda K. Karin M. Hotamisligil G.S. Nature. 2002; 420: 333-336Crossref PubMed Scopus (2679) Google Scholar, 12Wellen K.E. Hotamisligil G.S. J. Clin. Investig. 2005; 115: 1111-1119Crossref PubMed Scopus (3247) Google Scholar, 13Nguyen M.T. Satoh H. Favelyukis S. Babendure J.L. Imamura T. Sbodio J.I. Zalevsky J. Dahiyat B.I. Chi N.W. Olefsky J.M. J. Biol. Chem. 2005; 280: 35361-35371Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (339) Google Scholar), leading to cellular inflammation and insulin resistance. In man, elevated FFA levels are a feature of obesity and type 2 diabetes (12Wellen K.E. Hotamisligil G.S. J. Clin. Investig. 2005; 115: 1111-1119Crossref PubMed Scopus (3247) Google Scholar, 14Boden G. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. 2002; 5: 545-549Crossref PubMed Scopus (180) Google Scholar). In animal models, high fat (HF) feeding and direct lipid infusion can increase plasma FFA levels and cause tissue and systemic inflammation and insulin resistance (15Kraegen E.W. Cooney G.J. Ye J.M. Thompson A.L. Furler S.M. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 2001; 109: S189-S201Crossref PubMed Scopus (117) Google Scholar, 16Boden G. Diabetes. 1997; 46: 3-10Crossref PubMed Scopus (0) Google Scholar). Toll-like receptors (TLRs) are thought to participate in sensing extracellular FFAs. TLRs belong to the Toll/interleukin-1 receptor superfamily and are widely expressed on cells of the immune system (17Takeda K. Akira S. Int. Immunol. 2005; 17: 1-14Crossref PubMed Scopus (2752) Google Scholar, 18Liew F.Y. Xu D. Brint E.K. O'Neill L.A. Nat. Rev. Immunol. 2005; 5: 446-458Crossref PubMed Scopus (1272) Google Scholar). TLRs recognize bacteria-associated molecular patterns with high specificity, and TLR-mediated signal transduction leads to the activation of JNK and NFκB signaling pathways (17Takeda K. Akira S. Int. Immunol. 2005; 17: 1-14Crossref PubMed Scopus (2752) Google Scholar, 19Guha M. Mackman N. Cell Signal. 2001; 13: 85-94Crossref PubMed Scopus (2005) Google Scholar), initiating the innate immune response. The saturated FA, lauric acid, was shown to activate TLR2 in 293T cells as well as NFκB-mediated, TLR4-dependent signaling pathways in RAW264.7 cells (20Lee J.Y. Zhao L. Youn H.S. Weatherill A.R. Tapping R. Feng L. Lee W.H. Fitzgerald K.A. Hwang D.H. J. Biol. Chem. 2004; 279: 16971-16979Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (396) Google Scholar). Similarly, an oleate/palmitate mixture can induce NFκB-dependent TLR4 signaling in 293T cells and cause inflammation in wild type (WT) but not TLR4-deficient adipocytes. The saturated FA palmitate was also shown to cause TLR4-dependent IκBα degradation in elicited peritoneal macrophages (21Shi H. Kokoeva M.V. Inouye K. Tzameli I. Yin H. Flier J.S. J. Clin. Investig. 2006; 116: 3015-3025Crossref PubMed Scopus (2768) Google Scholar). In the present study, we examined the effects of saturated and unsaturated FFAs in cultured RAW264.7 cells, primary bone marrow (BM)-derived cells and adipose tissue macrophages. We demonstrate that FFAs signal through both TLR2 and TLR4 to activate JNK and stimulate inflammatory pathways in CD11c+ myeloid cells. We also show that in AT, F4/80+CD11b+CD11c+ cells are the direct targets for FFAs and that HF feeding increases the number of these cells in AT. As such, these results provide a novel mechanistic link between lipid metabolism, inflammation, and insulin resistance. Reagents—Antibodies to IL-6, MCP-1,TNF-α, and horseradish peroxidase-linked secondary antibodies were purchased from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), and all other antibodies were from Cell Signaling (Beverly, MA). Tissue culture reagents were purchased from Invitrogen and Hyclone (Logan, UT). Cell Culture and Treatment—Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 cells were obtained from American Type Culture Collection (Manassas, VA) and cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (1g/liter glucose) supplemented with 10% low endotoxin FBS. In pretreated cells, 1 μm rosiglitazone or vehicle Me2SO was added at least 24 h prior to FFA treatment. RAW cells were then incubated for 3 h with either 500 μm of an FFA mixture containing equimolar amounts of tissue culture-grade arachidonic, lauric, linoleic, oleic, and myristic acids or with individual FFAs (500 μm) or ethanol vehicle in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with FFA-free BSA (Sigma-Aldrich). All of the FFA solutions were pre-equilibrated with BSA at 37 °C for 1-1.5 h (22Spector A.A. John K. Fletcher J.E. J. Lipid Res. 1969; 10: 56-67Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar), and a 5:1 FFA:BSA ratio was used to simulate elevated FFAs levels. We ensured that all components for cell culture and treatment experiments contained very low or undetectable amounts of contaminating lipopolysaccharide by measuring endotoxin levels in the serum, culture medium, BSA preparation, and FFA stock solutions (LAL assay kit, Cambrex, East Rutherford, NJ). All of the solutions used contained undetectable amounts of endotoxin except for the BSA solution, which contained 0.3 EU/ml (0.03 ng/ml) of endotoxin. This amount of contaminating lipopolysaccharide was not sufficient to activate RAW264.7 cells and BMDCs. We found that treating RAW264.7 cells and BMDCs with 0.03 ng/ml of endotoxin for 3 h did not cause phosphorylation of JNK and secretion of TNF-α and JNK phosphorylation in these cells (data not shown). Western Blotting—The cells were lysed in cold buffer containing 50 mm HEPES, pH 7.4, 150 mm NaCl, 200 mm NaF, 20 mm sodium pyrophosphate, 10% glycerol, 1% Triton X-100, 4 mm sodium orthovanadate, 2 mm phenylmethylsulfonyl fluoride, and 1 mm EDTA. Whole cell lysates (25 μg) or conditioned medium (30 μl) were resolved by SDS-PAGE and transferred onto polyvinylidene difluoride membranes (Immobilon-P; Millipore, Bedford, MA). Following blocking with 5% milk in TBST, the membranes were probed with primary antibodies as indicated and subsequently incubated with horseradish peroxidase-linked secondary antibodies for chemiluminescent detection (Pierce). The blots were stripped in Restore™ Western blot stripping buffer (Pierce) and reprobed as necessary. Semi-quantitative RT-PCR—Total RNA was isolated and purified using RNeasy columns and RNase-free DNase according to the manufacturer's instructions (Qiagen). One-step RT-PCR kits (Qiagen) and sequence-specific primers (see supplemental Fig. S3) were used to generate RT-PCR products, which were then run on 8% acrylamide gels, stained with ethidium bromide, visualized, and quantitated using the Kodak ID Imaging station and software (Kodak Scientific Imaging Systems, New Haven, CT). Real Time PCR—Total RNA was isolated from cells as outlined above. First strand cDNA was synthesized using Super-Script III and random hexamers (Invitrogen). The samples were run in 20-μl reactions using an AB1 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA); SYBR Green oligonucleotides were used for detection, and sequence-specific primers are listed in supplemental Fig. S3. Gene expression levels were calculated after normalization to the standard housekeeping gene GAPDH using the ΔΔCT method as described by the manufacturer (Invitrogen) and expressed as relative mRNA levels compared with control. ELISA—Conditioned medium was assayed for mouse IL-1β, IL-6, MCP-1, and TNF-α using ELISA kits (BIOSOURCE, Camarillo, CA) following the manufacturer's protocol. Protein Knockdown—2 × 107 RAW264.7 cells were electroporated with 2.5 nmol of high pressure liquid chromatography-purified siRNA oligonucleotides (IDT, Coralville, IA) to mouse JNK1, JNK2, p65-NFκB, TLR2, or TLR4 or with luciferase control siRNA (oligonucleotide sequences in supplemental Fig. S3) using the XCell Gene Pulser (Bio-Rad). The cells were plated into 24-well tissue culture plates, and 24-48 h post-electroporation, they were treated with FFAs as described above. Conditioned medium and cell lysates were analyzed by immunoblotting. Isolation and Treatment of Bone Marrow-derived Cells—All of the animal experiments were performed humanely under protocols approved by the University of California, San Diego. TLR2/4 DKO male mice on a C57BL/6 background (kindly provided by Dr. Shizuo Akira, University of Osaka, Japan) and WT C57BL/6 male mice were maintained under specific pathogen-free conditions. Bone marrow cells were isolated from the femurs and tibias of 10-12-week-old homozygous and WT mice by flushing the medullary cavity with RPMI medium. After washing, the cells were seeded in tissue culture plates and differentiated into either bone marrow-derived macrophages (BMDMs) or bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs) in RPMI medium containing 30% of L-929 conditioned medium or 10 or 40 ng/ml of recombinant GM-CSF, respectively, and supplemented with 20% low endotoxin FBS and streptomycin/penicillin. We observed that differentiating precursor cells in 40 ng/ml of GM-CSF yielded more BMDCs than when using 10 ng/ml of GM-CSF. However, this higher GM-CSF concentration did not affect BMDC proinflammatory gene expression (IL-6, TNF-α, IL-1β, and COX-2), differentiation and cell surface antigen expression (F4/80, CD11b, and CD11c), as determined by qPCR and FACS analysis (data not shown). We were also able to differentiate BMDMs from bone marrow precursor cells using murine recombinant M-CSF (data not shown). BMDM and BMDC differentiation was complete 8 days after cell plating; this was confirmed by the expression of F4/80, a marker preferentially expressed by mature macrophages, and of CD11c, a cell surface marker for dendritic cells, using FACS (data not shown). For FFA experiments, day 8 or 9 BMDMs and BMDCs were stimulated with 500 μm FFA for 3 h, and conditioned medium and cell lysates were analyzed as indicated. Immunohistocytochemistry—Paraffin-embedded adipose tissue was sectioned, deparaffinized, and rehydrated prior to endogenous peroxidase and biotin removal using 0.03% H2O2 and 0.1% avidin. The slides were heated in 0.1 m citrate buffer for antigen retrieval, cooled, washed, and then blocked with 1% BSA in TBST. The sections were incubated overnight with CD11c primary antibody (eBioscience, San Diego, CA). Biotin-conjugated secondary and horseradish peroxidase-conjugated streptavidin tertiary antibodies were applied for detection, and the sections were developed in substrate chromogen, counterstained in Mayers Hematoxylin, and mounted in Gelmount Biomedia. Frozen quad muscle tissue was sectioned (5 um), air-dried, and fixed in acetone. After endogenous peroxidase removal using 0.03% H2O2, the sections were washed in PBS and blocked in 0.01% biotin for 15 min and then in 1% BSA in PBS for 30 min. Biotin-conjugated CD11c antibody was overlaid for 1 h, and the sections were further processed as outlined above. Animal Studies—Wild type male C57BL/6 and ob/obJ male mice were purchased from Harlan (Indianapolis, IN). The animals were housed in a pathogen-free facility with a 12-h light/12-h dark cycle and given free access to food and water. C57BL/6 mice were placed on a HFD consisting of 40% of calories from fat (TD.96132; Harlan Teklad, Madison, WI) starting at 12 weeks of age for 1, 12, or 20 weeks. Control C57BL/6 mice were fed a standard diet with 12% of calories from fat (LabDiet, 5001; Richmond, IN). The body weights and food intakes were recorded every week (data not shown). An insulin tolerance test (ITT) was performed on mice after 1 and 12 weeks of chow or HFD feeding. The mice were fasted for 6 h. After 4 h of fasting, basal plasma glucose was measured. At 6 h, the mice were injected intraperitoneal with 0.6 units of insulin/kg of body weight. Blood glucose was measured through the tail tip at the indicated times, using a OneTouch glucose-monitoring system (Lifescan, Milpitas, CA). Stromal Vascular Fraction (SVF) Isolation and FACS Analysis—Epididymal fat pads were excised from male C57BL/6 mice fed normal chow (NC) or HFD, weighed, rinsed three times in PBS, and then minced in FACS buffer (PBS + 1% low endotoxin BSA). Tissue suspensions were centrifuged at 500 × g for 5 min and then collagenase-treated (1 mg/ml; Sigma-Aldrich) for 30 min at 37 °C with shaking. The cell suspensions were filtered through a 100-μm filter and centrifuged at 500 × g for 5 min. SVF pellets were then incubated with RBC lysis buffer (eBioscience) for 5 min prior to centrifugation (300 × g for 5 min) and resuspension in FACS buffer. Stromal vascular cells (SVCs) were incubated with Fc Block (BD Biosciences, San Jose, CA) for 20 min at 4 °C prior to staining with fluorescently labeled primary antibodies or control IgGs for 25 min at 4 °C. F4/80-allophycocyanin FACS antibody was purchased from AbD Serotec (Raleigh, NC); all other fluorescein isothiocyanate- and phycoerythrin-conjugated FACS antibodies were from BD Biosciences. The cells were gently washed twice and resuspended in FACS buffer with propidium iodide (Sigma-Aldrich). SVCs were analyzed using FACSCalibur and FACSAria flow cytometers (BD Biosciences). Unstained, single stains, and fluorescence minus one controls were used for setting compensation and gates. Forcellsorting,F4/80+CD11b+CD11c−andF4/80+CD11b+-CD11c+ cells from lean, NC SVFs were sorted into FBS. Sorted cells were allowed to recover for 2 h. The cells were then washed and treated with FFA for subsequent RNA extraction and real time PCR analysis. Glucose Uptake Assay—BMDCs from WT and TLR2/4 DKO mice were treated with 500 μm FFA or vehicle for 3 h and then washed twice with RPMI medium to remove the FFAs. The cells were subsequently incubated with fresh culture medium containing 2% FBS. After 6 h of incubation, CM was harvested for ELISA analysis and co-culture experiments. L6 myocytes were cultured in α-minimal essential medium supplemented with 10% FBS and differentiated into myotubes in α-minimal essential medium containing 2% FBS for ∼6-7 days. The L6 myotube culture medium was then replaced with CM from BMDCs diluted 1:1 in fresh L6 differentiation medium. L6 myotubes were incubated with BMDC-derived CM for 24-48 h prior to assaying glucose uptake. For glucose uptake assays, L6 myotubes were serum starved for 3 h in α-minimal essential medium with 0.5% FFA-free BSA and then glucose-starved for 30 min in HEPES salt buffer containing 0.5% FFA-free BSA. The cells were stimulated with insulin (5 nm) at 37 °C for 20 min; tracer glucose was then added for 10 min. After 30 min of insulin stimulation, glucose uptake was assayed in quadruplicate wells for each condition using 1,2-3H-2-deoxy-d-glucose (0.2 μCi, 0.1 mm, 10 min) in four independent experiments. Data Analysis—Densitometric quantification and normalization were performed using the NIH Image 1.63 software. The values presented are expressed as the means ± S.E. The statistical significance of the differences between various treatments was determined by one-way analysis of variance with the Bonferroni correction. FFAs Cause a Proinflammatory Response in RAW264.7 Cells—Recent studies suggest that chronic inflammation in AT is an important mechanism underlying the insulin resistance associated with obesity, HF feeding, and diabetes and that infiltrating macrophages may be responsible for the activation of proinflammatory pathways (6Bouloumie A. Curat C.A. Sengenes C. Lolmede K. Miranville A. Busse R. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. 2005; 8: 347-354Crossref PubMed Scopus (228) Google Scholar, 23Kolb H. Mandrup-Poulsen T. Diabetologia. 2005; 48: 1038-1050Crossref PubMed Scopus (345) Google Scholar). Because FFAs are released in AT, we studied the effects of FFAs on AT macrophage function. We first treated RAW264.7 murine monocyte/macrophage cells with a mixture of saturated and unsaturated FFAs and surveyed various stress/inflammatory signaling responses. FFA treatment broadly activated the JNK and IKKβ signaling pathways (Fig. 1A), in a time- and concentration-dependent manner, with JNK activation being observed as early as 5 min after FFA treatment (data not shown). After washing to remove FFAs, followed by a 12-h recovery period, inflammatory markers returned to base-line levels, and the cells were once again responsive to lipopolysaccharide stimulation (data not shown). Thus, the proinflammatory effects of FFAs were specific and reversible and did not result from cell toxicity. When the cells were treated with 500 μm FFA for 3 h, we observed induction of the proinflammatory genes IL-1β, IL-6, MCP-1, and MMP-9, an increase in intracellular MCP-1 and TNF-α levels, and an increase in secreted proinflammatory chemo/cytokines IL-1β, IL-6, MCP-1, and TNF-α (supplemental Fig. S1, A-C). When we tested individual FAs, each FA in the mixture, except for myristic acid, was able to activate the proinflammatory kinase pathways in RAW264.7 cells and increased intracellular and secreted TNF-α levels, albeit to different degrees (supplemental Fig. S1, D and E). Overall, the unsaturated FA arachidonic acid was most potent in causing these effects. We assessed whether a TZD, rosiglitazone, could inhibit FFA-induced inflammation in RAW264.7 cells and found that all the FFA-induced effects were attenuated by pretreatment with rosiglitazone (supplemental Fig. S2, A-C). Contribution of JNK and IKKβ-NFκB to the FFA Proinflammatory Effects—Previous reports have documented that FFAs induce mostly NFκB-dependent effects, and we observed that FFA treatment activated both JNK and IKKβ signaling pathways. Therefore, we assessed the contribution of these two kinases to the overall FFA effect using siRNAs targeted specifically against JNK1, JNK2, and p65-NFκB. JNK1 and JNK2 siRNAs decreased levels of both JNK protein isoforms by >70% (13Nguyen M.T. Satoh H. Favelyukis S. Babendure J.L. Imamura T. Sbodio J.I. Zalevsky J. Dahiyat B.I. Chi N.W. Olefsky J.M. J. Biol. Chem. 2005; 280: 35361-35371Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (339) Google Scholar), and p65-NFκB siRNA decreased p65 protein levels by ∼75% (Fig. 1B). JNK knockdown (KD) significantly reduced basal MMP-9, IL-1β, TNF-α, and COX-2 gene expression levels, and inhibited the FFA-induced up-regulation in IL-1β and MMP-9 gene expression (Fig. 1C). In contrast, knocking down p65 produced smaller inhibitory effects on gene expression. Moreover, JNK KD resulted in decreased FFA-induced intracellular and secreted TNF-α levels (Fig. 1D), whereas p65 KD, while having the expected effect to decrease phosphorylation of NFκB, had little or no effect on intracellular and secreted TNF-α (Fig. 1E). This suggested that JNK plays a more central role in mediating the FFA-induced proinflammatory effects in RAW264.7 cells. We thus focused on examining the role of JNK kinase in mediating the effects of FFAs. TLR2 and TLR4 Mediate FA Signaling in RAW264.7 Cells—TLRs are expressed on monocytes and macrophages, and it has been reported that bacterial lipopolysaccharide, which contains an FA moiety, can induce proinflammatory effects through TLR4 (17Takeda K. Akira S. Int. Immunol. 2005; 17: 1-14Crossref PubMed Scopus (2752) Google Scholar, 24Poltorak A. He X. Smirnova I. Liu M.Y. Van Huffel C. Du X. Birdwell D. Alejos E. Silva M. Galanos C. Freudenberg M. Ricciardi-Castagnoli P. Layton B. Beutler B. Science. 1998; 282: 2085-2088Crossref PubMed Scopus (6514) Google Scholar, 25Hoshino K. Takeuchi O. Kawai T. Sanjo H. Ogawa T. Takeda Y. Takeda K. Akira S. J. Immunol. 1999; 162: 3749-3752Crossref PubMed Google Scholar). Thus, we hypothesized that TLR4, and possibly TLR2, another member of the TLR family, could mediate the FFA proinflammatory signals. To test this idea, siRNAs were used to knockdown TLR4 and TLR2 proteins in RAW264.7 cells (Fig. 2A), achieving ∼50% and ∼75% KD efficiency for TLR2 and TLR4, respectively (bar graph in Fig. 2A). TLR2 KD significantly reduced basal expression of MMP-9, IL-1β, and TNF-α genes, whereas TLR4 KD reduced the basal expression of these genes and that of COX-2 (Fig. 2B). TLR2 and TLR4 KD also inhibited the FFA-induced up-regulation in IL-1β and MMP-9 gene expression. Fig. 2C shows that in the TLR2 KD cells, FFA-induced JNK phosphorylation was inhibited, as was the increase in intracellular and secreted TNF-α levels. When TLR4 was depleted, these proinflammatory responses were also inhibited, but to a greater extent (Fig. 2D). These results indicate that both TLR4 and TLR2 play a role in mediating FA signaling via JNK activation. Studies in Bone Marrow-derived Cells—RAW264.7 cells have been extensively used as a model cell line for studies of macrophage biology. We found that RAW264.7 cells express high levels of the macrophage and myeloid cell surface markers F4/80 and CD11b but also high levels of a cell surface marker more typical of dendritic and T cells, CD11c (data not shown). With this in mind, and given the heterogeneity and plasticity of the macrophage population, we further examined the effects of FFAs in two types of primary myeloid-derived cell types: BMDMs, which express F4/80, CD11b but not CD11c, and BMDCs, which express all three markers. BMDMs and BMDCs were prepared as described in detail under “Experimental Procedures.” According to previously established methods, the phenotype of these primary cells was confirmed by FACS using fluorescently labeled antibodies showing that BMDMs express F4/80 and CD11b, whereas BMDCs are positive for F4/80, CD11b, and CD11c (data not shown). To characterize these two cell types, we examined the expression of inflammatory genes by qPCR (Fig. 3A). The relative expression of COX-2, CCR2, IL-1β, IL-6, and TNF-α genes was strikingly higher in BMDCs than BMDMs (p < 0.05 or less), suggesting that BMDCs possess greater proinflammatory activity than BMDMs. Consistent with this, BMDMs expressed high levels of anti-inflammatory cytokine IL-10, whereas BMDCs exhibited no detectable levels of IL-10. BMDMs and BMDCs have been shown to express TLR2 and TLR4. Because BMDCs have heightened proinflammatory activity and because FFAs exert their inflammat

Syndrome X, typified by obesity, insulin resistance (IR), dyslipidemia, and other metabolic abnormalities, is responsive to antidiabetic thiazolidinediones (TZDs). Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) γ, a target of TZDs, is expressed abundantly in adipocytes, suggesting an important role for this tissue in the etiology and treatment of IR. Targeted deletion of PPARγ in adipose tissue resulted in marked adipocyte hypocellularity and hypertrophy, elevated levels of plasma free fatty acids and triglyceride, and decreased levels of plasma leptin and ACRP30. In addition, increased hepatic glucogenesis and IR were observed. Despite these defects, blood glucose, glucose and insulin tolerance, and insulin-stimulated muscle glucose uptake were all comparable to those of control mice. However, targeted mice were significantly more susceptible to high-fat diet-induced steatosis, hyperinsulinemia, and IR. Surprisingly, TZD treatment effectively reversed liver IR, whereas it failed to lower plasma free fatty acids. These results suggest that syndrome X may be comprised of separable PPARγ-dependent components whose origins and therapeutic sites may reside in distinct tissues.

Troglitazone decreases insulin resistance and hyperglycemia in patients with non-insulin-dependent diabetes mellitus (NIDDM), but its effects on subjects without diabetes are not known.We performed oral and intravenous glucose-tolerance tests, studies with the euglycemic-hyperinsulinemic clamp, meal-tolerance tests, and 24-hour blood-pressure measurements at base line and after the administration of troglitazone, 200 mg orally twice daily, or placebo for 12 weeks in 18 nondiabetic obese subjects, 9 of whom had impaired glucose tolerance.The mean (+/- SD) rates of glucose disposal increased from 4.7 +/- 1.7 to 6.0 +/- 1.7 mg per kilogram of body weight per minute (P = 0.004) and from 9.0 +/- 1.8 to 9.9 +/- 1.3 mg per kilogram per minute (P = 0.02) during insulin infusions of 40 and 300 mU per square meter of body-surface area per minute, respectively, in the troglitazone group. The insulin-sensitivity index, calculated from the results of intravenous glucose-tolerance tests, increased from 0.7 +/- 0.6 x 10(-4) to 1.6 +/- 0.9 x 10(-4) in subjects given troglitazone, and their glycemic response to oral glucose and to mixed meals decreased. The mean fasting plasma insulin concentration decreased by 48 percent (P = 0.002), and the plasma insulin response to oral glucose and mixed meals decreased by 40 and 41 percent, respectively. The changes were similar in the subjects with normal glucose tolerance and those with impaired glucose tolerance. Systolic and diastolic blood pressure decreased by 5 +/- 2 mm Hg (P = 0.05) and 4 +/- 2 mm Hg (P = 0.04), respectively, after treatment with troglitazone. There were virtually no changes in the placebo group.Troglitazone decreases insulin resistance and improves glucose tolerance in obese subjects with either impaired or normal glucose tolerance. The ability of troglitazone to reduce insulin resistance could be useful in preventing NIDDM:

MiRNAs are regulatory molecules that can be packaged into exosomes and secreted from cells. Here, we show that adipose tissue macrophages (ATMs) in obese mice secrete miRNA-containing exosomes (Exos), which cause glucose intolerance and insulin resistance when administered to lean mice. Conversely, ATM Exos obtained from lean mice improve glucose tolerance and insulin sensitivity when administered to obese recipients. miR-155 is one of the miRNAs overexpressed in obese ATM Exos, and earlier studies have shown that PPARγ is a miR-155 target. Our results show that miR-155KO animals are insulin sensitive and glucose tolerant compared to controls. Furthermore, transplantation of WT bone marrow into miR-155KO mice mitigated this phenotype. Taken together, these studies show that ATMs secrete exosomes containing miRNA cargo. These miRNAs can be transferred to insulin target cell types through mechanisms of paracrine or endocrine regulation with robust effects on cellular insulin action, in vivo insulin sensitivity, and overall glucose homeostasis.

Infiltration of various immune cell types into the fat tissue and liver has been implicated in obesity-induced insulin resistance. Jerry Olefsky and his colleagues now show that neutrophils are one of the earliest immune cells to arrive in these tissues, that they release the protease neutrophil elastase and that this enzyme degrades IRS-1, a key member of the insulin signaling pathway. These results show that neutrophils contribute to insulin resistance and how they may do so. Chronic low-grade adipose tissue and liver inflammation is a major cause of systemic insulin resistance and is a key component of the low degree of insulin sensitivity that exists in obesity and type 2 diabetes1,2. Immune cells, such as macrophages, T cells, B cells, mast cells and eosinophils, have all been implicated as having a role in this process3,4,5,6,7,8. Neutrophils are typically the first immune cells to respond to inflammation and can exacerbate the chronic inflammatory state by helping to recruit macrophages and by interacting with antigen-presenting cells9,10,11. Neutrophils secrete several proteases, one of which is neutrophil elastase, which can promote inflammatory responses in several disease models12. Here we show that treatment of hepatocytes with neutrophil elastase causes cellular insulin resistance and that deletion of neutrophil elastase in high-fat-diet–induced obese (DIO) mice leads to less tissue inflammation that is associated with lower adipose tissue neutrophil and macrophage content. These changes are accompanied by improved glucose tolerance and increased insulin sensitivity. Taken together, we show that neutrophils can be added to the extensive repertoire of immune cells that participate in inflammation-induced metabolic disease.

Studies were done to determine whether the minimal model approach and the glucose clamp measure equivalent indices of insulin action. Euglycemic glucose clamps (glucose, G: 85 mg/dl) were performed at two rates of insulin (I) infusion (15 and 40 mU/min per m2) in 10 subjects (body mass index, BMI, from 21 to 41 kg/m2). Insulin sensitivity index (SI) from clamps varied from 0.15 to 3.15 (mean: 1.87 +/- 0.36 X 10(-2) dl/[min per m2] per microU/ml), and declined linearly with increasing adiposity (versus BMI: r = -0.97; P less than 0.001). SI from modeling the modified frequently sampled intravenous tolerance test varied from 0.66 to 7.34 X 10(-4) min-1 per microU/ml, and was strongly correlated with SIP(clamp) (r = 0.89; P less than 0.001). SI and SIP(clamp) were similar (0.046 +/- 0.008 vs. 0.037 +/- 0.007 dl/min per microU/ml, P greater than 0.35); the relation had a slope not different from unity (1.05 P greater than 0.70) and passed through the origin (P greater than 0.40). However, on a period basis, SI exceeded SIP(clamp) slightly, due to inhibition of hepatic glucose output during the FSIGT, not included in SIP(clamp). These methods are equivalent for assessment of overall insulin sensitivity in normal and insulin-resistant nondiabetic subjects.