Formation of the apical surface and lumen is a fundamental, yet poorly understood, step in epithelial organ development. We show that PTEN localizes to the apical plasma membrane during epithelial morphogenesis to mediate the enrichment of PtdIns(4,5)P2 at this domain during cyst development in three-dimensional culture. Ectopic PtdIns(4,5)P2 at the basolateral surface causes apical proteins to relocalize to the basolateral surface. Annexin 2 (Anx2) binds PtdIns(4,5)P2 and is recruited to the apical surface. Anx2 binds Cdc42, recruiting it to the apical surface. Cdc42 recruits aPKC to the apical surface. Loss of function of PTEN, Anx2, Cdc42, or aPKC prevents normal development of the apical surface and lumen. We conclude that the mechanism of PTEN, PtdIns(4,5)P2, Anx2, Cdc42, and aPKC controls apical plasma membrane and lumen formation.

Influenza A viruses (IAV) bind to sialic-acids at cellular surfaces and enter cells by using endocytotic routes. There is evidence that this process does not occur constitutively but requires induction of specific cellular signals, including activation of PI3K that promotes virus internalization. This implies engagement of cellular signaling receptors during viral entry. Here, we present first indications for an interplay of IAV with receptor tyrosine kinases (RTKs). As representative RTK family-members the epidermal growth factor receptor (EGFR) and the c-Met receptor were studied. Modulation of expression or activity of both RTKs resulted in altered uptake of IAV, showing that these receptors transmit entry relevant signals upon virus binding. More detailed studies on EGFR function revealed that virus binding lead to clustering of lipid-rafts, suggesting that multivalent binding of IAV to cells induces a signaling platform leading to activation of EGFR and other RTKs that in turn facilitates IAV uptake.

ABSTRACT The SARS-COV-2 pandemic and the global spread of coronavirus disease 2019 (COVID-19) urgently calls for efficient and safe antiviral treatment strategies. A straightforward approach to speed up drug development at lower costs is drug repurposing. Here we investigated the therapeutic potential of targeting the host- SARS-CoV-2 interface via repurposing of clinically licensed drugs and evaluated their use in combinatory treatments with virus- and host-directed drugs. We tested the antiviral potential of repurposing the antifungal itraconazole and the antidepressant fluoxetine on the production of infectious SARS-CoV-2 particles in the polarized Calu-3 cell culture model and evaluated the added benefit of a combinatory use of these host-directed drugs with remdesivir, an inhibitor of viral RNA polymerase. Drug treatments were well-tolerated and potent impaired viral replication was observed with all drug treatments. Importantly, both itraconazole-remdesivir and fluoxetine-remdesivir combinations inhibited the production of infectious SARS-CoV-2 particles > 90% and displayed synergistic effects in commonly used reference models for drug interaction. Itraconazole-Remdesivir and Fluoxetine-Remdesivir combinations are promising therapeutic options to control SARS-CoV-2 infection and severe progression of COVID-19.

Abstract Pattern Recognition Receptors are key in identifying pathogenic or damaged cell-related patterns or molecules. Among these, the closely linked formyl peptide receptors FPR1 and FPR2 are believed to hold pivotal yet differing functions in immune regulation. To address the intriguing question of how these highly related receptors with a shared agonist spectrum play differing roles in modulating inflammation, we analyzed the signaling profile for a panel of FPR agonists in vivo and ex vivo settings. Our analysis uncovered a shared core signature for both FPRs across signaling pathways. Whereas formylated peptides generally acted as potent agonists at FPR1, FPR2 agonists, irrespective of N-terminal formylation, displayed consistently low activity ratios, suggesting an underutilized signaling potential of this receptor. Signaling outcomes were defined by specific agonist-receptor pairings and no receptor-specific signaling texture was identified. Activation of the FPR signaling axis by fMLF in human neutrophils did impact neutrophil survival. Overall, the distinct characteristics underlying inflammatory, anti-inflammatory, or pro-resolving profiles could not be attributed to a specific receptor isoform, signaling pattern, or a particular class of agonists, challenging assumptions about distinct inflammatory profiles linked to specific receptors, signaling patterns, or agonist classes.

Abstract In response to pro-inflammatory challenges including pathogenic attack and tissue damage, the endothelial cell surface is rearranged to present leukocyte-engaging cell surface receptors. The initial contact needed for leukocyte tethering and rolling is mediated via adhesion demand-driven exocytosis of Weibel-Palade bodies (WPB) that contain the leukocyte receptor P-selectin together with the stabilizing co-factor CD63. We found that diminished expression of the endolysosomal non-selective cation channel TPC2 or inhibition of TPC2-mediated Ca 2+ -release via trans-Ned 19 led to reduced endolysosomal Ca 2+ efflux, and blocked transfer of CD63 from late endosomes/lysosomes (LEL) to WPB, and a concomitant loss of P-selectin on the endothelial cell surface. Accordingly, P-selectin-mediated leukocyte recruitment to trans-Ned 19-treated HUVEC under flow was significantly reduced without disturbing VWF exocytosis. Our findings establish the endolysosome-related TPC2 Ca 2+ channel as a key element in the maintenance of proper endothelial functions and a potential pharmacological target in the control of inflammatory leukocyte recruitment.

The functional GPCR unit consists of an agonist acting on a receptor that is coupled to a G protein that transduces the signals to effectors within a complex cellular environment. While much attention is given to GPCR-agonist or GPCR-transducer relationships, the contribution of the cell environment is less well investigated. Here, we compared the signals transmitted upon activation of two pattern recognition receptors, Formyl peptide receptor 1 and Formyl peptide receptor 2 in a recombinant cell model with the FPR-mediated signaling texture in the physiological neutrophilic environment. We observed that agonist activation lead to substantial differences in de novo cAMP generation, depending on the cell context, whereas MAPK activation was similar in both systems. The physiological bias was conserved across species. Thus, a generic signal provided by different receptors leads to discrete responses that depend on the specific identity of the signal-receiving cell, thus highlighting the cellular context as a decisive component in GPCR-mediated signal transduction.

Summary The Sonic hedgehog (Shh) pathway controls embryonic development and tissue homeostasis after birth. Long-lasting questions about this pathway are how dual-lipidated, firmly plasma membrane-associated Shh ligand is released from producing cells to signal to distant target cells, and how the resistance-nodulation-division transporter Dispatched (Disp) regulates this process. Here we show that Disp inactivation in Shh expressing cells specifically impairs proteolytic Shh release from its lipidated terminal peptides, a process called ectodomain shedding. Shh shedding from Disp-deficient cells was restored by pharmacological membrane cholesterol extraction and by overexpressed transgenic Disp or structurally related Patched (Ptc, a putative cholesterol transporter). These data suggest that Disp regulates physiological Shh function via controlled cell surface shedding and that molecular mechanisms shared by Disp and Ptc exercise such sheddase control.

Abstract The Corona Virus Disease 2019 (COVID-19) pandemic caused by the Severe Acute Respiratory Syndrome Related Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is a global health emergency. As only very limited therapeutic options are clinically available, there is an urgent need for the rapid development of safe, effective, and globally available pharmaceuticals that inhibit SARS-CoV-2 entry and ameliorate COVID-19. In this study, we explored the use of small compounds acting on the homeostasis of the endolysosomal host-pathogen interface, to fight SARS-CoV-2 infection. We find that fluoxetine, a widely used antidepressant and a functional inhibitor of acid sphingomyelinase (FIASMA), efficiently inhibited the entry and propagation of SARS-CoV-2 in the cell culture model without cytotoxic effects and also exerted potent antiviral activity against two currently circulating influenza A virus subtypes, an effect which was also observed upon treatment with the FIASMAs amiodarone and imipramine. Mechanistically, fluoxetine induced both impaired endolysosomal acidification and the accumulation of cholesterol within the endosomes. As the FIASMA group consists of a large number of small compounds that are well-tolerated and widely used for a broad range of clinical applications, exploring these licensed pharmaceuticals may offer a variety of promising antivirals for host-directed therapy to counteract enveloped viruses, including SARS-CoV-2 and COVID 19.