A comparison of seven dCas9-based transcriptional activators shows that VPR, SAM, and Suntag perform best in cell lines from a variety of organisms. Several programmable transcription factors exist based on the versatile Cas9 protein, yet their relative potency and effectiveness across various cell types and species remain unexplored. Here, we compare Cas9 activator systems and examine their ability to induce robust gene expression in several human, mouse, and fly cell lines. We also explore the potential for improved activation through the combination of the most potent activator systems, and we assess the role of cooperativity in maximizing gene expression.

Abstract The frizzled ( fz ) and disheveled ( dsh ) genes are highly conserved members of the core planar cell polarity (PCP) pathway and of the Wnt signaling pathway. Given these dual functions, a number of studies have examined whether Wnt ligands may provide a global, tissue-scale orientation cue for PCP establishment during development, and these studies have reached differing conclusions. In this study, we re-examine this issue in the Drosophila melanogaster wing and notum using split-Gal4 co-expression analysis, systematic pairwise and triple somatic CRISPR-based knock-outs and double RNAi experiments. Pairwise loss-of-function experiments targeting wg together with other Wnt genes does not produce PCP defects, neither via somatic CRISPR nor RNAi. In addition, somatic knock-out of evi (aka wntless ), which is required for the secretion of all Wnt ligands expressed in these tissues, did not produce detectable PCP phenotypes. Altogether, we were unable to find support for the hypothesis that Wnt ligands contribute to PCP signaling in the Drosophila wing or notum.

CRISPR/Cas9-based transcriptional activation (CRISPRa) has recently emerged as a powerful and scalable technique for systematic over-expression genetic analysis in Drosophila melanogaster. We present flySAM, a potent new tool for in vivo CRISPRa, which offers a major improvement over existing strategies in terms of effectiveness, scalability, and ease-of-use. flySAM outperforms existing in vivo CRISPRa strategies, and approximates phenotypes obtained using traditional Gal4-UAS over-expression. Further, because flySAM typically only requires a single sgRNA, it dramatically improves scalability. We use flySAM to demonstrate multiplexed CRISPRa, which has not been previously shown in vivo. In addition, we have simplified the experimental usage of flySAM by creating a single vector encoding both the UAS:Cas9-activator and the sgRNA, allowing for inducible CRISPRa in a single genetic cross. flySAM will thus replace previous CRISPRa strategies as the basis of our growing genome-wide transgenic over-expression resource, TRiP-OE.

Screening for successful CRISPR/Cas9 editing events remains a time consuming technical bottleneck in the field of Drosophila genome editing. This step can be particularly laborious for events that do not cause a visible phenotype, or those which occur at relatively low frequency. A promising strategy to enrich for desired CRISPR events is to co-select for an independent CRISPR event that produces an easily detectable phenotype. Here, we describe a simple negative co-selection strategy involving CRISPR-editing of a dominant female sterile allele, ovoD1. In this system (“ovoD co-selection”), the only functional germ cells in injected females are those that have been edited at the ovoD1 locus, and thus 100% of the offspring of these flies have undergone editing of at least one locus. We demonstrate that ovoD co-selection can be used to enrich for knock-out mutagenesis via nonhomologous end-joining (NHEJ), and for knock-in alleles via homology-directed repair (HDR). Altogether, our results demonstrate that ovoD co-selection reduces the amount of screening necessary to isolate desired CRISPR events in Drosophila.

Summary The ability to independently control gene expression in two different tissues in the same animal is emerging as a major need, especially in the context of inter-organ communication studies. This type of study is made possible by technologies combining the GAL4/UAS and a second binary expression system such as the LexA-system or QF-system. Here, we describe a resource of reagents that facilitate combined use of the GAL4/UAS and a second binary system in various Drosophila tissues. Focusing on genes with well-characterizsed GAL4 expression patterns, we generated a set of more than 40 LexA-GAD and QF2 insertions by CRISPR knock-in and verified their tissue-specificity in larvae. We also built constructs that encode QF2 and LexA-GAD transcription factors in a single vector. Following successful integration of this construct into the fly genome, FLP/FRT recombination is used to isolate fly lines that express only QF2 or LexA-GAD. Finally, using new compatible shRNA vectors, we evaluated both LexA and QF systems for in vivo gene knockdown and are generating a library of such RNAi fly lines as a community resource. Together, these LexA and QF system vectors and fly lines will provide a new set of tools for researchers who need to activate or repress two different genes in an orthogonal manner in the same animal.

Abstract Paralogs are genes which arose via gene duplication, and when such paralogs retain overlapping or redundant function, this poses a challenge to functional genetics research. Recent technological advancements have made it possible to systematically probe gene function for redundant genes using dual or multiplex gene perturbation, and there is a need for a simple bioinformatic tool to identify putative paralogs of a gene(s) of interest. We have developed Paralog Explorer ( https://www.flyrnai.org/tools/paralogs/ ), an online resource that allows researchers to quickly and accurately identify candidate paralogous genes in the genomes of the model organisms D. melanogaster, C. elegans, D. rerio, M. musculus , and H. sapiens . Paralog Explorer deploys an effective between-species ortholog prediction software, DIOPT, to analyze within-species paralogs. Paralog Explorer allows users to identify candidate paralogs, and to navigate relevant databases regarding gene co-expression, protein-protein and genetic interaction, as well as gene ontology and phenotype annotations. Altogether, this tool extends the value of current ortholog prediction resources by providing sophisticated features useful for identification and study of paralogous genes.

Abstract Novel genes have the potential to drive the evolution of new biological mechanisms, or to integrate into pre-existing regulatory circuits and contribute to the regulation of older, conserved biological functions. One such gene, the novel insect-specific gene oskar , was first identified based on its role in establishing the Drosophila melanogaster germ line. We previously showed that this gene likely arose through an unusual domain transfer event involving bacterial endosymbionts, and played a somatic role before evolving its well-known germ line function. Here, we provide empirical support for this hypothesis in the form of evidence for a novel neural role for oskar . We show that oskar is expressed in the adult neural stem cells of a hemimetabolous insect, the cricket Gryllus bimaculatus . In these stem cells, called neuroblasts, oskar is required together with the ancient animal transcription factor Creb to regulate long-term (but not short-term) olfactory memory. We provide evidence that oskar positively regulates Creb , which plays a conserved role in long-term memory across animals, and that oskar in turn may be a direct target of Creb. Together with previous reports of a role for oskar in nervous system development and function in crickets and flies, our results are consistent with the hypothesis that oskar ’s original somatic role may have been in the insect nervous system. Moreover, its co-localization and functional cooperation with the conserved pluripotency gene piwi in the nervous system may have facilitated oskar ’s later co-option to the germ line in holometabolous insects.

Abstract The split-Gal4 system allows for intersectional genetic labeling of highly specific cell-types and tissues in Drosophila . However, the existing split-Gal4 system, unlike the standard Gal4 system, cannot be repressed by Gal80, and therefore cannot be controlled temporally. This lack of temporal control precludes split-Gal4 experiments in which a genetic manipulation must be restricted to specific timepoints. Here, we describe a new split-Gal4 system based on a self-excising split-intein, which drives transgene expression as strongly as the current split-Gal4 system and Gal4 reagents, yet which is fully repressible by Gal80. We demonstrate the potent inducibility of “split-intein Gal4” in vivo using both fluorescent reporters and via reversible tumor induction in the gut. Further, we show that our split-intein Gal4 can be extended to the drug-inducible GeneSwitch system, providing an independent method for intersectional labeling with inducible control. We also show that the split-intein Gal4 system can be used to generate highly cell-type specific genetic drivers based on in silico predictions generated by single cell RNAseq (scRNAseq) datasets, and we describe a new algorithm (“Two Against Background” or TAB) to predict cluster-specific gene pairs across multiple tissue-specific scRNA datasets. We provide a plasmid toolkit to efficiently create split-intein Gal4 drivers based on either CRISPR knock-ins to target genes or using enhancer fragments. Altogether, the split-intein Gal4 system allows for the creation of highly specific intersectional genetic drivers that are inducible/repressible. Significance statement The split-Gal4 system allows Drosophila researchers to drive transgene expression with extraordinary cell type specificity. However, the existing split-Gal4 system cannot be controlled temporally, and therefore cannot be applied to many important areas of research. Here, we present a new split-Gal4 system based on a self-excising split-intein, which is fully controllable by Gal80, as well as a related drug-inducible split GeneSwitch system. This approach can both leverage and inform single-cell RNAseq datasets, and we introduce an algorithm to identify pairs of genes that precisely and narrowly mark a desired cell cluster. Our split-intein Gal4 system will be of value to the Drosophila research community, and allow for the creation of highly specific genetic drivers that are also inducible/repressible.

The Transgenic RNAi Project (TRiP), a Drosophila functional genomics platform at Harvard Medical School, was initiated in 2008 to generate and distribute a genome-scale collection of RNAi fly stocks. To date, the TRiP has generated >15,000 RNAi fly stocks. As this covers most Drosophila genes, we have largely transitioned to development of new resources based on CRISPR technology. Here, we present an update on our libraries of publicly available RNAi and CRISPR fly stocks, and focus on the TRiP-CRISPR overexpression (TRiP-OE) and TRiP-CRISPR knockout (TRiP-KO) collections. TRiP-OE stocks express sgRNAs targeting upstream of a gene transcription start site. Gene activation is triggered by co-expression of catalytically dead Cas9 (dCas9) fused to an activator domain, either VP64-p65-Rta (VPR) or Synergistic Activation Mediator (SAM). TRiP-KO stocks express one or two sgRNAs targeting the coding sequence of a gene or genes, allowing for generation of indels in both germline and somatic tissue. To date, we have generated more than 5,000 CRISPR-OE or -KO stocks for the community. These resources provide versatile, transformative tools for gene activation, gene repression, and genome engineering.

Abstract Despite the deep conservation of the DNA damage response pathway (DDR), cells in different contexts vary widely in their susceptibility to DNA damage and their propensity to undergo apoptosis as a result of genomic lesions. One of the cell signaling pathways implicated in modulating the DDR is the highly conserved Wnt pathway, which is known to promote resistance to DNA damage caused by ionizing radiation in a variety of human cancers. However, the mechanisms linking Wnt signal transduction to the DDR remain unclear. Here, we use a genetically encoded system in Drosophila to reliably induce consistent levels of DNA damage in vivo , and demonstrate that canonical Wnt signaling in the wing imaginal disc buffers cells against apoptosis in the face of DNA double-strand breaks. We show that Wg, the primary Wnt ligand in Drosophila , activates Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) signaling via the ligand-processing protease Rhomboid, which in turn modulates the DDR in a Chk2, p53, and E2F1- dependent manner. These studies provide mechanistic insight into the modulation of the DDR by the Wnt and EGFR pathways in vivo in a highly proliferative tissue. Furthermore, they reveal how the growth and patterning functions of Wnt signaling are coupled with pro-survival, anti-apoptotic activities, thereby facilitating developmental robustness in the face of genomic damage. Author Summary Ectopic activation of the highly conserved Wnt signaling pathway has been previously demonstrated to promote resistance to radiation and chemoradiation therapy in a variety of human cancers, yet the mechanisms by which Wnt modulates the DDR pathway are not clearly established. Furthermore, putative interactions between Wnt signaling and the DDR outside the context of pathological Wnt over-expressing tumors have not been clearly elucidated. Here, we show that, in Drosophila , loss of canonical Wnt signaling during development of the highly proliferative wing imaginal disc sensitizes cells to DNA damage, biasing them towards apoptosis and ultimately disrupting normal wing development. In contrast, ectopic Wnt signaling reduces the level of apoptosis for a given level of DNA damage. Mechanistically, we demonstrate that Wnt signaling acts via Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) signaling, a well characterized pro-survival pathway, by activating the ligand-processing protease Rhomboid, and that this effect requires core DDR components Chk2, p53, and E2F1. Altogether, we show that Wnt signaling can promote developmental robustness by opposing apoptosis in the face of DNA damage, and reveal a mechanism by which Wnt signaling modulates the DDR via EGFR signaling.