Abstract Rhodamines have been continuously optimized in brightness, biocompatibility, and colors to fulfill the demands of modern bioimaging. However, the problem of phototoxicity caused by the excited fluorophore under long-term illumination has been largely neglected, hampering their use in time-lapse imaging. Here we introduce cyclooctatetraene (COT) conjugated rhodamines that span the visible spectrum and exhibit significantly reduced phototoxicity. We identified a general strategy for the generation of Gentle Rhodamines, which preserved their outstanding spectroscopic properties and cell permeability while showing an efficient reduction of singlet-oxygen formation and diminished cellular photodamage. Paradoxically, their photobleaching kinetics do not go hand in hand with reduced phototoxicity. By combining COT-conjugated spirocyclization motifs with targeting moieties, these gentle rhodamines compose a toolkit for time-lapse imaging of mitochondria, DNA, and actin and synergize with covalent and exchangeable HaloTag labeling of cellular proteins with less photodamage than their commonly used precursors. Taken together, the Gentle Rhodamines generally offer alleviated phototoxicity and allow advanced video recording applications, including voltage imaging.

Plasma membrane stains are one of the most important organelle markers for unambiguous assignments of individual cells and monitoring membrane morphology and dynamics. The state-of-the-art PM stains are bright, specific, fluorogenic, and compatible with super-resolution imaging. However, when recording membrane dynamics, particularly under light-intensive microscopes, PM is prone to photodynamic damages due to its phospholipid bilayer nature. Here we developed PK Mem dyes tailored for time-lapse fluorescence imaging. By integrating triplet-state quenchers into the MemBright dyes featuring cyanine chromophores and amphiphilic zwitterion anchors, PK Mem dyes exhibited a three-fold reduction in phototoxicity and a more than four-fold improvement in photostability in imaging experiments. These dyes enable 2D and 3D imaging of live or fixed cancer cell lines and a wide range of primary cells, at the same time pair well with various fluorescent markers. PK Mem dyes can be applied to neuronal imaging in brain slices and in vivo two-photon imaging. The gentle nature of PK Mem palette enables ultralong-term recording of cell migration and cardiomyocyte beating. Notably, PK Mem dyes are optically compatible with STED/SIM imaging, which can handily upgrade the routine of time-lapse neuronal imaging, such as growth cone tracking and mitochondrial transportations, into nanoscopic resolutions.