Abstract Most biologically active oxysterols have a 3β-hydroxy-5-ene function in the ring system with an additional site of oxidation at C-7 or on the side-chain. In blood plasma oxysterols with a 7α-hydroxy group are also observed with the alternative 3-oxo-4-ene function in the ring system formed by ubiquitously expressed 3β-hydroxy-Δ 5 -C 27 -steroid oxidoreductase Δ 5 -isomerase, HSD3B7. However, oxysterols without a 7α-hydroxy group are not substrates for HSD3B7 and are not usually observed with the 3-oxo-4-ene function. Here we report the unexpected identification of oxysterols in plasma derived from umbilical cord blood and blood from pregnant women taken before delivery at 37+ weeks of gestation, of side-chain oxysterols with a 3-oxo-4-ene function but no 7α-hydroxy group. These 3-oxo-4-ene oxysterols were also identified in placenta, leading to the hypothesis that they may be formed by a previously unrecognised 3β-hydroxy-Δ 5 -C 27 -steroid oxidoreductase Δ 5 -isomerase activity of HSD3B1, an enzyme which is highly expressed in placenta. Proof of principle experiments confirmed that HSD3B1 has this activity. We speculate that HSD3B1 in placenta is the source of the unexpected 3-oxo-4-ene oxysterols in cord and pregnant women’s plasma and may have a role in controlling the abundance of biologically active oxysterols delivered to the fetus.

Abstract Loss-of-function mutations in KMT2D are a striking feature of the germinal centre (GC) lymphomas, resulting in decreased H3K4 methylation and altered gene expression. We hypothesised that inhibition of the KDM5 family, which demethylates H3K4me3/me2, would re-establish H3K4 methylation and restore the expression of genes repressed upon loss of KMT2D . KDM5-inhibition increased H3K4me3 levels and caused an anti-proliferative response in vitro , which was markedly greater in both endogenous and CRISPR-edited KMT2D mutant DLBCL cell lines, whilst tumour growth was inhibited in KMT2D mutant xenografts in vivo . KDM5-inhibition reactivated both KMT2D-dependent and -independent genes, resulting in diminished B-cell receptor signalling and altered expression of BCL2 family members, including BCL2 itself, allowing it to synergise with agents targeting these pathways. KDM5-inhibition may offer an effective therapeutic strategy for ameliorating KMT2D loss-of-function mutations in GC-lymphomas. Statement of significance We detail a novel way of reverting the effects of loss-of-function mutations in the histone methyltransferase KMT2D by inhibiting the KDM5 demethylase family, increasing levels of H3K4me3 and restoring expression of KMT2D regulated genes.

ABSTRACT Background IDH1/2 -mutant gliomas are primary brain tumors for which curative treatments are lacking. Mutant IDH-dependent 2-hydroxyglutarate (2-HG) accumulation leads to DNA and histone hypermethylation. Based on this distinct phenotype, we interrogated epigenetic dependencies of IDH -mutant glioma that can be targeted therapeutically. Methods We conducted a chemical screen targeting chromatin modifiers in patient derived IDH1 -mutant GBM cells. We investigated mechanisms of action of compound hits and their combinations through cell-based functional assays, live-cell imaging, Western blot, CRISPR knockout, RNA-seq and ChIP experiments. The therapeutic concept was validated in vivo using chemical inhibitors GSK-J4 and Belinostat in an orthotopic GBM model. Results We identified the H3K27me3 demethylase (KDM6) inhibitor GSK-J4 and histone deacetylase inhibitor Belinostat as potent, genotype-selective agents against IDH1 -mutant glioma. RNA-sequencing on paired wild-type and IDH1 R132H cells revealed inhibition of cholesterol biosynthesis and activation of cellular stress in IDH1 R132H cells, which were reversible with a mutant IDH1 inhibitor. GSK-J4 caused further repression of cholesterol biosynthesis pathway genes through H3K27me3 deposition and exacerbated the ATF4-mediated integrated stress response. Belinostat inhibited anti-apoptotic pathways through activation of TGF-β signaling and induced cell cycle arrest. Together, the GSK-J4 and Belinostat combination activated DDIT3 /CHOP-dependent apoptosis in IDH1 -mutant cells and extended survival in an IDH1 -mutant orthotopic model in vivo . Conclusions These results provide a possible therapeutic approach that exploits epigenetic vulnerabilities of IDH -mutant gliomas. Key points - Combination of GSK-J4 and Belinostat selectively targets IDH1 -mutant cells. - GSK-J4 downregulates cholesterol biosynthesis and activates an ATF4-mediated stress response. - Belinostat activates the TGFβ pathway, induces G2/M arrest and inhibits anti-apoptotic pathways. Importance of the study IDH1/2 genes are frequently mutated in low grade glioma and secondary glioblastoma. These tumors exhibit a distinct epigenomic signature with increased DNA and histone methylation; therefore, identifying and exploiting their epigenetic vulnerabilities may lead to effective therapies. We discovered that targeting of KDM6A/6B together with HDACs provides a promising therapeutic approach for IDH1 -mutant glioma.

Abstract Droplet-based single-cell sequencing techniques have provided unprecedented insight into cellular heterogeneities within tissues. However, these approaches only allow for the measurement of the distal parts of a transcript following short-read sequencing. Therefore, splicing and sequence diversity information is lost for the majority of the transcript. The application of long-read Nanopore sequencing to droplet-based methods is challenging because of the low base-calling accuracy currently associated with Nanopore sequencing. Although several approaches that use additional short-read sequencing to error-correct the barcode and UMI sequences have been developed, these techniques are limited by the requirement to sequence a library using both short- and long-read sequencing. Here we introduce a novel approach termed single-cell Barcode UMI Correction sequencing (scBUC-seq) to efficiently error-correct barcode and UMI oligonucleotide sequences synthesized by using blocks of dimeric nucleotides. The method can be applied to correct either short-read or long-read sequencing, thereby allowing users to recover more reads per cell and permits direct single-cell Nanopore sequencing for the first time. We illustrate our method by using species-mixing experiments to evaluate barcode assignment accuracy and evaluate differential isoform usage and fusion transcripts using myeloma and sarcoma cell line models.

Abstract Unique Molecular Identifiers (UMIs) are random oligonucleotide sequences that remove PCR amplification biases. However, the impact that PCR associated sequencing errors have on the accuracy of generating absolute counts of RNA molecules is underappreciated. We show that PCR errors are the main source of inaccuracy in both bulk and single-cell sequencing data, and synthesizing UMIs using homotrimeric nucleotide blocks provides an error correcting solution, that allows absolute counting of sequenced molecules.

Single-cell transcriptomics, reliant on the incorporation of barcodes and unique molecular identifiers (UMIs) into captured polyA+ mRNA, faces a significant challenge due to synthesis errors in oligonucleotide capture sequences. These inaccuracies, which are especially problematic in long-read sequencing, impair the precise identification of sequences and result in inaccuracies in UMI deduplication. To mitigate this issue, we have modified the oligonucleotide capture design, which integrates an interposed anchor between the barcode and UMI, and a 'V' base anchor adjacent to the polyA capture region. This configuration is devised to ensure compatibility with both short and long-read sequencing technologies, facilitating improved UMI recovery and enhanced feature detection, thereby improving the efficacy of droplet-based sequencing methods.

ABSTRACT Uterine fibroids (UFs), benign tumours prevalent in up to 80% of women of reproductive age, are associated with significant morbidity, including abnormal uterine bleeding, pain and infertility. Despite identification of key genomic alterations in MED12 and HMGA2, the pathogenic mechanisms underlying UFs and heavy menstrual bleeding (HMB) remain poorly understood. To correlate systematically genetic, transcriptional and proteomic phenotypes, our study involved an integrative analysis of fibroid, myometrium and endometrium tissues from 137 patients, utilising genome-wide SNP arrays, targeted sequencing, RNA sequencing and proteomics. Our findings reveal 39.7% of UFs possess MED12 mutations, alongside novel variants in genes such as COL4A5 and COL4A6. Multi-omics factor analysis of integrated protein and mRNA highlighted differential regulation related to extracellular matrix remodelling, proteolysis and homeostasis in fibroid versus myometrium tissues, and distinct gene sets associated with RNA splicing in the endometrium of patients with HMB, particularly in MED12-mutated fibroids. Our study proposes a model, which is supported by in vivo evidence, where altered signalling of MED12-mutated fibroids influences RNA transcript isoform expression in endometrium, potentially leading to abnormal uterine bleeding. This integrative approach unravels complex molecular pathways in UF pathogenesis and HMB, offering novel insights for targeted therapeutic development.