3076 Background: Ataxia telangiectasia and Rad3-related (ATR) protein kinase is activated by replication stress and recruited to stalled forks or single strand DNA abnormalities in various cancers. The topoisomerase-I (Top1) inhibitor topotecan induces DNA damage. The ATR inhibitor BAY 1895344 (elimusertib) has demonstrated cytotoxic potential in small cell lung cancer and gastrointestinal cancer xenografts when combined with Top1 inhibitors . Methods: This is phase Ia study of elimusertib combined with topotecan in adult patients with refractory advanced solid tumors for whom topotecan can be considered as part of standard care. Patients with previous topotecan exposure were excluded. The study combination was assessed starting at Topotecan 1 mg/m 2 IV (D1-D5) plus elimusertib 20 mg BID (D2, D5) (Cycle=21 days). Dose escalation utilized a 3+3 design. Primary objectives were to assess safety and tolerability and estimate the maximum tolerated dose (MTD) and recommended phase 2 dose (RP2D) of the combination. Secondary objectives included estimating pharmacokinetic (PK) profiles and assessing anti-tumor activity of the combinations. Results: Eight patients were treated in dose escalation. Participants were a median of 63 years old and had received 2 median lines of previous therapy. The initial two patients enrolled into dose level (DL) 1 had dose-limiting toxicities with one of patient experiencing respiratory failure and cardiac arrest in setting of pancytopenia related to study drug. Six patients were subsequently enrolled in and received DL-1 (elimusertib decreased from 20 mg BID to 20 mg Daily) and no DLTs were observed. Notable grade 3+ treatment-related adverse events and summary best response are summarized in Table. Disease control rate was 43% among evaluation patient including one unconfirmed partial response. Median progression-free survival in the RP2D cohort was 3.45 months. PK studies are in process and results will be presented at time of meeting. Conclusions: RP2D and MTD was established for elimusertib in combination with Topotecan: Topotecan 1 mg/m 2 IV [D1-D5] plus elimusertib 20 mg Daily [D2, D5] every 3 weeks. Dose escalation was notably limited by myelotoxicity. Due to sponsor decision, the study was halted prior to planned expansions cohorts but the concept of ATR + topo I inhibition remains relevant. Clinical trial information: NCT04514497 . [Table: see text]

SUMMARY ATR kinase is a central regulator of the DNA damage response (DDR) and cell cycle checkpoints. ATR kinase inhibitors (ATRi’s) combine with radiation to generate CD8 + T cell-dependent responses in mouse models of cancer. We show that ATRi’s induce CDK1-dependent origin firing across active replicons in CD8 + T cells activated ex vivo while simultaneously decreasing the activity of rate-limiting enzymes for nucleotide biosynthesis. These pleiotropic effects of ATRi induce deoxyuridine (dU) contamination in genomic DNA, R loops, RNA-DNA polymerase collisions, and type-1 interferons (IFN-1). Remarkably, thymidine rescues ATRi-induced dU contamination, cell death, and IFN-1 expression in proliferating CD8 + T cells. Thymidine also rescues ATRi-induced cancer cell death. We propose that ATRi-induced dU contamination contributes to dose-limiting leukocytopenia and inflammation in the clinic and CD8 + T cell dependent anti-tumor responses in mouse models. We conclude that ATR is essential to limit dU contamination in genomic DNA and IFN-1 expression.

4168 Background: Optimal therapy for patients with locally advanced pancreatic adenocarcinoma (LAPC) is unknown, though consensus guidelines suggest induction chemotherapy followed by radiation as an option for treatment. In preclinical work, synergy was observed with the addition of DNA-PK inhibitor peposertib to radiation in pancreatic cancer cell lines and xenograft models. This phase 1 dose escalation trial (NCT04172532) evaluated the safety and tolerability of peposertib in combination with hypofractionated radiotherapy in patients with LAPC following induction chemotherapy. Methods: Patients with LAPC following 4-6 months of induction chemotherapy with FOLFIRINOX or gemcitabine/nab-paclitaxel were eligible. Patients received stereotactic body radiotherapy (SBRT) in 5 fractions delivered every other day, in combination with peposertib daily for 14 days during the SBRT period. The peposertib dose was escalated according to a 3+3 design, and the SBRT dose was escalated from 33Gy to 40Gy in an additional dose level after the highest peposertib dose was deemed safe. The dose limiting toxicity (DLT) window extended for 30 days following the last treatment. Plasma pharmacokinetics were assessed for the combination. Following study treatment, patients were allowed to proceed with additional therapy as per standard guidelines. Results: A total of 18 patients with locally advanced pancreatic adenocarcinoma were enrolled across 7 ETCTN sites in dose escalation. No dose limiting toxicities were observed across the 4 dose levels: 1) 100 mg, 2) 200 mg, 3) 300 mg peposertib daily x 14 days in combination with SBRT 6.6 Gy x 5 fractions, and 4) peposertib 300 mg daily x 14 days with SBRT at the higher dose of 8 Gy x 5 fractions. As no DLT was observed in 6 total patients treated at the top dose level (4), this was determined the recommended phase 2 dose. Most common treatment emergent adverse events across all dose levels included nausea, fatigue, abdominal pain, and diarrhea, most of which were grade 1 or 2 in severity. A total of 4 grade 3 adverse events were observed, and included lymphocyte count decrease (2), fatigue and anemia. Two grade 5 events were documented in study participants treated at dose level 3, one attributed to complications of a Whipple procedure, and the second attributed to disease progression following hospitalization for sepsis associated with a PICC line infection. Both events were deemed unrelated to study treatment. PK evaluation is ongoing and will be reported. Conclusions: Peposertib 300 mg daily x 14 days in combination with SBRT at a dose of 8 Gy x 5 fractions is the recommended phase 2 dose. A randomized phase 2 study is now enrolling to further assess the efficacy of the combination in patients with LAPC. Clinical trial information: NCT04172532 .

DNA damage and cytoplasmic DNA induce type-1 interferon (IFN-1) and potentiate responses to immune checkpoint inhibitors. Our prior work found that inhibitors of the DNA damage response kinase ATR (ATRi) induce IFN-1 and deoxyuridine (dU) incorporation by DNA polymerases, akin to antimetabolites. Whether and how dU incorporation is required for ATRi-induced IFN-1 signaling is not known. Here, we show that ATRi-dependent IFN-1 responses require uracil DNA glycosylase (UNG)-initiated base excision repair and STING. Quantitative analyses of nine distinct nucleosides reveals that ATRi induce dU incorporation more rapidly in UNG wild-type than knockout cells, and that induction of IFN-1 is associated with futile cycles of repair. While ATRi induce similar numbers of micronuclei in UNG wild-type and knockout cells, dU containing micronuclei and cytoplasmic DNA are increased in knockout cells. Surprisingly, DNA fragments containing dU block STING-dependent induction of IFN-1, MHC-1, and PD-L1. Furthermore, UNG knockout sensitizes cells to IFN-γ

ABSTRACT Diffuse gliomas are epigenetically dysregulated, immunologically cold, and fatal tumors characterized by mutations in isocitrate dehydrogenase (IDH). Although IDH mutations yield a uniquely immunosuppressive tumor microenvironment, the regulatory mechanisms that drive the immune landscape of IDH mutant (IDHm) gliomas remain unknown. Here, we reveal that transcriptional repression of retinoic acid (RA) pathway signaling impairs both innate and adaptive immune surveillance in IDHm glioma through epigenetic silencing of retinol binding protein 1 (RBP1) and induces a profound anti-inflammatory landscape marked by loss of inflammatory cell states and infiltration of suppressive myeloid phenotypes. Restorative retinoic acid therapy in murine glioma models promotes clonal CD4 + T cell expansion and induces tumor regression in IDHm, but not IDH wildtype (IDHwt), gliomas. Our findings provide a mechanistic rationale for RA immunotherapy in IDHm glioma and is the basis for an ongoing investigator-initiated, single-center clinical trial investigating all-trans retinoic acid (ATRA) in recurrent IDHm human subjects.

Abstract ATR kinase is a central regulator of the DNA damage response. While ATR kinase inhibitors (ATRi’s) are known to sensitize cancer cells to DNA damage, their effect on immune cells is not known. Here we show in mice that short-course AZD6738 (ATRi) on days 1-3 decreases proliferating T cells in the tumor and periphery and that cessation of ATRi causes a proliferative rebound. Integrating radiation on days 1-2 (RT) with ATRi on days 1-3 increases IFN-β in the tumor and activates tumor antigen-specific CD8 + T cells in the tumor-draining lymph node (DLN). RT with short-course ATRi induces an expansion of tumor antigen-specific CD8 + T cells in the DLN. In contrast, RT with prolonged daily ATRi blocks expansion of antigen-specific CD8 + T cells, despite increased IFN-β and activation of CD8 + T cells. Our data identifies critical schedule considerations for ATRi with RT, immunotherapy and genotoxic therapies.

Abstract To support a phase 1 trial in patients with lymphomas, we developed a liquid chromatography–tandem mass spectrometry (LC–MS/MS) method for tazemetostat quantitation in 20 μL of human plasma. After protein precipitation, chromatographic separation employed a Kinetex C18 column and a gradient of 0.1% formic acid in both water and acetonitrile, during a 3‐min run time. Detection was achieved using a SCIEX 6500+ tandem mass spectrometer with electrospray positive‐mode ionization. Validation was based on the latest Food and Drug Administration guidance. With a stable isotopic internal standard, the assay was linear within the range of 10–5000 ng/mL and proved to be accurate (91.9%–103.7%) and precise (<4.4% imprecision). Recovery varied between 93.3% and 121.1%, and matrix effect ranged from −25.5% to −4.9%. Hemolysis, lipemia, and dilution did not impact quantitation. Plasma stability was confirmed after three freeze–thaw cycles, 24 h at room temperature, and 4 months at −80°C. Incurred sample reanalysis yielded 94.4% samples within 20% difference ( n = 36). External validation showed a mean bias of −11.1%. Pharmacokinetic (PK) data obtained from three patients suggested variable concentration time profiles, warranting collection of further data. The assay proved to be suitable for tazemetostat quantitation in human plasma and will support clinical studies by defining tazemetostat PKs.

ABSTRACT Victims of a radiation terrorist event will include pregnant women and unborn fetuses. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress are key pathogenic factors of fetal irradiation injury. The goal of this preclinical study is to investigate the efficacy of mitigating fetal irradiation injury by maternal administration of the mitochondrial-targeted gramicidin S (GS)- nitroxide radiation mitigator, JP4-039. Pregnant female C57BL/6NTac mice received 3 Gy total body ionizing irradiation (TBI) at mid-gestation embryonic day 13.5 (E13.5). Using novel time- and-motion-resolved 4D in utero magnetic resonance imaging (4D-uMRI), we found TBI caused extensive injury to the fetal brain that included cerebral hemorrhage, loss of cerebral tissue, and hydrocephalus with excessive accumulation of cerebrospinal fluid (CSF). Histopathology of the fetal mouse brain showed broken cerebral vessels and elevated apoptosis. Further use of novel 4D Oxy-wavelet MRI capable of probing in vivo mitochondrial function in intact brain revealed significant reduction of mitochondrial function in the fetal brain after 3Gy TBI. This was validated by ex vivo Oroboros mitochondrial respirometry. Maternal administration JP4-039 one day after TBI (E14.5), which can pass through the placental barrier, significantly reduced fetal brain radiation injury and improved fetal brain mitochondrial respiration. This also preserved cerebral brain tissue integrity and reduced cerebral hemorrhage and cell death. As JP4-039 administration did not change litter sizes or fetus viability, together these findings indicate JP4-039 can be deployed as a safe and effective mitigator of fetal radiation injury from mid-gestational in utero ionizing radiation exposure. One Sentence Summary Mitochondrial-targeted gramicidin S (GS)-nitroxide JP4-039 is safe and effective radiation mitigator for mid-gestational fetal irradiation injury.

3077 Background: ATR protein kinase is activated by replication stress and recruited to stalled forks or single strand DNA defects in various cancers. The topoisomerase-I (Top1) inhibitor irinotecan induces DNA damage. The ATR inhibitor BAY1895344 (elimusertib) has demonstrated cytotoxic potential in SCLC and GI cancer xenografts when combined with Top1 inhibitors . Methods: This phase Ia trial assessed elimusertib in combination with irinotecan in adult patients with refractory advanced solid tumors for whom irinotecan can be considered standard care. Patients with previous irinotecan exposure were excluded. Two dosing schedules were used: 1) Biweekly - irinotecan IV (starting at 150 mg/m 2 ) D1 + elimusertib (starting dose 20 mg PO BID) D1,D2 (cycle=14 days); 2) Weekly - irinotecan (starting at 50 mg/m 2 ) IV on D1,8,15 with elimusertib (starting at 20 mg PO daily) on D2,D3,D9,D10 and D16,D17 (cycle=21 days). Dose escalation utilized a 3+3 design. Primary objectives were to assess safety and tolerability and estimate the maximum tolerated dose (MTD) and recommended phase 2 dose (RP2D). Secondary objectives included estimating pharmacokinetic (PK) profiles and assessing anti-tumor activity. Results: A total of 21 patients were enrolled in dose escalation (N=9 [Biweekly] and N=12 [Weekly], median age 58 and 2 lines of prior therapy. For the Biweekly cohort: 3/3 patients enrolled at dose level (DL) 1 experienced hematologic dose-limiting toxicity (DLT); 6 patients received DL-1 without any DLTs. The weekly regimen escalation comprised of 12 patients: 6 enrolled in DL1 with 2/6 having hematologic DLT and 5/6 unable to complete ≥75% of cycle 1 dosing; 6 enrolled in DL-1 with no DLTs observed. Notable grade 3+ treatment-related adverse events and summary best response are summarized (Table 1). The majority of evaluable patients in both schedules had initial disease control (56% [biweekly] and 67% [weekly]). One confirmed partial response was seen in the biweekly RP2D. Median progression-free survival was 2.1 mo [biweekly] and 2.5 mo [weekly]. PK results will be presented at time of meeting. Conclusions: Both RP2D and MTD of elimusertib in combination with irinotecan were reached for both dosing schedules: irinotecan 150 mg/m 2 IV D1 + elimusertib 10 mg BID PO D1,D2 (biweekly) and irinotecan 25 mg/m 2 IV on D1 + elimusertib (20 mg PO daily) on D2,D3 (weekly). Dose escalation was notably limited by myelotoxicity. Due to sponsor decision, the study was halted prior to planned expansion but the concept of ATR + topo I combination remains scientifically relevant. Clinical trial information: NCT04514497 . [Table: see text]