The PLUMED consortium unifies developers and contributors to PLUMED, an open-source library for enhanced-sampling, free-energy calculations and the analysis of molecular dynamics simulations. Here, we outline our efforts to promote transparency and reproducibility by disseminating protocols for enhanced-sampling molecular simulations.

Significance Parkinson’s disease is characterized by the presence in brain tissues of aberrant aggregates primarily formed by the protein α-synuclein. It has been difficult, however, to identify compounds capable of preventing the formation of such deposits because of the complexity of the aggregation process of α-synuclein. By exploiting recently developed highly quantitative in vitro assays, we identify a compound, squalamine, that blocks α-synuclein aggregation, and characterize its mode of action. Our results show that squalamine, by competing with α-synuclein for binding lipid membranes, specifically inhibits the initiation of the aggregation process of α-synuclein and abolishes the toxicity of α-synuclein oligomers in neuronal cells and in an animal model of Parkinson’s disease.

Abstract The discovery that disordered proteins are widespread in the human proteome has prompted the quest for methods to characterize the conformational properties that determine their functional and dysfunctional behaviour. It has become customary to describe these proteins in terms of structural ensembles and free energy landscapes, which offer conformational and thermodynamic insight. However, a current major challenge is to generalize this description to ‘kinetic ensembles’, thereby also providing information on transition rates between states. Approaches based on the theory of stochastic processes can be particularly suitable for this purpose. Here, we develop a Markov state model and illustrate its application by determining a kinetic ensemble of the 42-residue form of the amyloid-β peptide (Aβ42), whose aggregation is associated with Alzheimer’s disease. Using the Google Compute Engine, we generated 315 μs all-atom, explicit solvent molecular dynamics trajectories, validated with experimental data from nuclear magnetic resonance spectroscopy. Using a probabilistic-based definition of conformational states in a neural network approach, we found that Aβ42 is characterized by inter-state transitions no longer than the microsecond timescale, exhibiting only fully unfolded or short-lived, partially-folded states. We contextualize our findings by performing additional simulations of the oxidized form of Aβ42. Our results illustrate how the use of kinetic ensembles offers an effective means to provide information about the structure, thermodynamics, and kinetics of disordered proteins towards an understanding of these ubiquitous biomolecules.

Abstract The stabilisation of native states of proteins is a powerful drug discovery strategy. It is still unclear, however, whether this approach can be applied to intrinsically disordered proteins. Here we report a small molecule that stabilises the native state of the Aβ42 peptide, an intrinsically disordered protein fragment associated with Alzheimer’s disease. We show that this stabilisation takes place by a dynamic binding mechanism, in which both the small molecule and the Aβ42 peptide remain disordered. This disordered binding mechanism involves enthalpically favourable local π-stacking interactions coupled with entropically advantageous global effects. These results indicate that small molecules can stabilise disordered proteins in their native states through transient non-specific interactions that provide enthalpic gain while simultaneously increasing the conformational entropy of the proteins.

Intrinsically disordered proteins are highly dynamic biomolecules that rapidly interconvert between many structural conformations. Traditionally, these proteins have been considered un-druggable because of their lack of classical long-lived binding pockets. Recent evidence suggests that intrinsically disordered proteins can bind small, drug-like molecules, however, there are limited approaches to characterize these interactions experimentally. Here we demonstrate that ligand-detected 19 F transverse relaxation rates ( R 2 ) obtained from Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy are highly sensitive to the interaction between a small-molecule and an intrinsically disordered protein, in contrast to chemical shift perturbations which are minimally sensitive for this interaction. With this method, we show that the small molecule, 5-fluoroindole, interacts with the disordered domains of non-structural protein 5A from hepatitis C virus with a K d of 260 ± 110 μM. We also demonstrate that 5-fluoroindole remains highly dynamic in the bound form. Our findings suggest that ligand-detected 19 F transverse relaxation measurements could represent a highly effective screening strategy to identify molecules capable of interacting with these traditionally elusive, dynamic biomolecules.

Intrinsically disordered proteins (IDPs) often contain proline residues, which undergo cis/trans isomerisation. While molecular dynamics (MD) simulations have the potential to fully characterise the proline cis and trans sub-ensembles, they are limited by the slow timescales of isomerisation and force field inaccuracies. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy can report on ensemble-averaged observables for both the cis-proline and trans-proline states, but a full atomistic characterisation of these conformers is challenging. Given the importance of proline cis/trans isomerisation for influencing the conformational sampling of disordered proteins, we employed a combination of all-atom MD simulations with enhanced sampling (metadynamics), NMR, and small-angle X-ray scattering (SAXS) to characterise the two sub-ensembles of the ORF6 C-terminal region (ORF6

ABSTRACT Intrinsically disordered proteins (IDPs) often contain proline residues, which undergo cis/trans isomerisation. While molecular dynamics (MD) simulations have the potential to fully characterise the proline cis and trans sub-ensembles, they are limited by the slow timescales of isomerisation and force field inaccuracies. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy can report on ensemble-averaged observables for both the cis and trans proline states, but a full atomistic characterisation of these sub-ensembles is challenging. Given the importance of proline cis/trans isomerisation for influencing the conformational sampling of disordered proteins, we employed a combination of all-atom MD simulations with enhanced sampling (metadynamics), NMR, and small-angle X-ray scattering (SAXS) to characterise the two sub-ensembles of the ORF6 C-terminal region (ORF6 CTR ) from SARS-CoV-2 corresponding to the proline-57 (P57) cis and trans states. We performed MD simulations in three distinct force fields: AMBER03ws, AMBER99SB- disp , and CHARMM36m, which are all optimised for disordered proteins. Each simulation was run for an accumulated time of 180-220 µs until convergence was reached, as assessed by blocking analysis. A good agreement between the cis -P57 populations predicted from metadynamics simulations in AMBER03ws was observed with populations obtained from experimental NMR data. Moreover, we observed good agreement between the radius of gyration predicted from the metadynamics simulations in AMBER03ws and that measured using SAXS. Our findings suggest that both the cis -P57 and trans -P57 conformations of ORF6 CTR are extremely dynamic and that interdisciplinary approaches combining both multi-scale computations and experiments offer avenues to explore highly dynamic states that cannot be reliably characterised by either approach in isolation. SIGNIFICANCE This study employs MD simulations (with metadynamics), NMR spectroscopy, and SAXS to elucidate the individual cis and trans proline conformations of ORF6 CTR from SARS-CoV-2. The good agreement on proline cis / trans populations observed in experiments (NMR) and those calculated from simulations in the AMBER03ws force field (with SAXS reweighting) showcases the efficiency of this interdisciplinary approach, which can be used to characterise highly dynamic disordered protein states, even for very slow processes. Furthermore, our study emphasises the importance of considering both computational and experimental methodologies to gain a more holistic understanding of highly dynamic proteins. The presented integrative approach sets a precedent for future studies aiming to explore complex and dynamic biological systems with slow transitions such as proline isomerisations.

Understanding the mechanism of action of compounds capable of inhibiting protein aggregation is critical to the development of potential therapeutics against protein misfolding diseases. A fundamental challenge for progress is the range of possible target species and the disparate timescales involved, since the aggregating proteins are simultaneously the reactants, products, intermediates and catalysts of the reaction. It is a complex problem, therefore, to choose the states of the aggregating proteins that should be bound by the compounds to achieve the most potent inhibition. We present here a comprehensive kinetic theory of protein aggregation inhibition which reveals the fundamental thermodynamic and kinetic signatures characterising effective inhibitors by identifying quantitative relationships between the aggregation and binding rate constants. These results provide general physical laws to guide the design and optimisation of protein aggregation inhibitors.

Disordered proteins are challenging therapeutic targets, and no drug is currently in clinical use that has been shown to modify the properties of their monomeric states. Here, we identify a small molecule capable of binding and sequestering the amyloid-β peptide (Aβ) in its monomeric, soluble state. Our analysis reveals that this compound interacts with Aβ and inhibits both the primary and secondary nucleation pathways in its aggregation process. We characterise this interaction using biophysical experiments and integrative structural ensemble determination methods. We thus observe that this small molecule has the remarkable effect of increasing the conformational entropy of monomeric Aβ while decreasing its hydrophobic surface area. We then show that this small molecule rescues a Caenorhabditis elegans model of Aβ-associated toxicity in a manner consistent with the mechanism of action identified from the in silico and in vitro studies. These results provide an illustration of the strategy of targeting the monomeric states of disordered proteins with small molecules to alter their behaviour for therapeutic purposes.

Fluorine ( 19 F) NMR is emerging as an invaluable analytical technique in chemistry, biochemistry, material science, and medicine, especially due to the inherent rarity of naturally occurring fluorine in biological, organic, and inorganic compounds. Thus, we were surprised to identify an unexpected peak in our 19 F NMR spectra, corresponding to free fluoride, which appears to leach out from various types of new and unused glass NMR tubes over the course of several hours. We quantified this contaminant to be at micromolar concentrations for typical NMR sample volumes across multiple glass types and brands. We find that this artefact is undetectable for samples prepared in quartz NMR tubes within the timeframes of our experiments. We also observed that pre-soaking new glass NMR tubes combined with rinsing removes this contamination below micromolar levels. Given the increasing popularity of 19 F NMR across a wide range of fields, the long collection times required for relaxation studies and samples of low concentrations, and the importance of avoiding contamination in all NMR experiments, we anticipate that our simple solution will be useful to biomolecular NMR spectroscopists.