Bioorthogonal ligation methods with improved reaction rates and less obtrusive components are needed for site-specifically labeling proteins without catalysts. Currently no general method exists for in vivo site-specific labeling of proteins that combines fast reaction rate with stable, nontoxic, and chemoselective reagents. To overcome these limitations, we have developed a tetrazine-containing amino acid, 1, that is stable inside living cells. We have site-specifically genetically encoded this unique amino acid in response to an amber codon allowing a single 1 to be placed at any location in a protein. We have demonstrated that protein containing 1 can be ligated to a conformationally strained trans-cyclooctene in vitro and in vivo with reaction rates significantly faster than most commonly used labeling methods.

Installing stable, functional mimics of phosphorylated amino acids into proteins offers a powerful strategy to study protein regulation. Previously, a genetic code expansion (GCE) system was developed to translationally install non-hydrolyzable phosphoserine (nhpSer), with the γ-oxygen replaced with carbon, but it has seen limited usage. Here, we achieve a 40-fold improvement in this system by engineering into Escherichia coli a biosynthetic pathway that produces nhpSer from the central metabolite phosphoenolpyruvate. Using this "PermaPhos Ser " system - an autonomous 21-amino acid E. coli expression system for incorporating nhpSer into target proteins - we show that nhpSer faithfully mimics the effects of phosphoserine in three stringent test cases: promoting 14-3-3/client complexation, disrupting 14-3-3 dimers, and activating GSK3β phosphorylation of the SARS-CoV-2 nucleocapsid protein. This facile access to nhpSer containing proteins should allow nhpSer to replace Asp and Glu as the go-to pSer phosphomimetic for proteins produced in E. coli .

Abstract The ability to site-specifically modify proteins at multiple sites in vivo will enable the study of protein function in its native environment with unprecedented levels of detail. Here, we present a versatile two-step strategy to meet this goal involving site-specific encoding of two distinct noncanonical amino acids bearing bioorthogonal handles into proteins in vivo followed by mutually orthogonal labeling. This general approach, that we call d ual e ncoding a nd labeling (DEAL), allowed us to efficiently encoded tetrazine- and azide-bearing amino acids into a protein and demonstrate for the first time that the bioorthogonal labeling reactions with strained alkene and alkyne labels can function simultaneously and intracellularly with high yields when site-specifically encoded in a single protein. Using our DEAL system, we were able to perform topologically-defined protein-protein crosslinking, intramolecular stapling, and site-specific installation of fluorophores all inside living Escherichia coli cells, as well as study the DNA-binding properties of yeast Replication Protein A in vitro . By enabling the efficient dual modification of proteins in vivo , this DEAL approach provides a tool for the characterization and engineering of proteins in vivo .

Abstract Nucleophosmin (NPM1) is the 46th most abundant human protein with many functions whose dysregulation leads to various cancers. Pentameric NPM1 resides in the nucleolus but can also shuttle to the cytosol. NPM1 is regulated by multisite phosphorylation, yet molecular consequences of site-specific NPM1 phosphorylation remain elusive. Here we identify four 14-3-3 protein binding sites in NPM1 concealed within its oligomerization and α-helical C-terminal domains that are found phosphorylated in vivo . By combining mutagenesis, in-cell phosphorylation and PermaPhos technology for site-directed incorporation of a non-hydrolyzable phosphoserine mimic, we show how phosphorylation promotes NPM1 monomerization and partial unfolding, to recruit 14-3-3 dimers with low-micromolar affinity. Using fluorescence anisotropy we quantified pairwise interactions of all seven human 14-3-3 isoforms with four recombinant NPM1 phosphopeptides and assessed their druggability by fusicoccin. This revealed a complex hierarchy of 14-3-3 affinities toward the primary (S48, S293) and secondary (S106, S260) sites, differentially modulated by the small molecule. As three of these 14-3-3 binding phospho-sites in NPM1 reside within signal sequences, this work highlights a key mechanism of NPM1 regulation by which NPM1 phosphorylation promotes 14-3-3 binding to control nucleocytoplasmic shuttling. It also provides further evidence that phosphorylation-induced structural rearrangements of globular proteins serve to expose otherwise cryptic 14-3-3-binding sites that are important for cellular function.

Abstract The aromatic side-chains of phenylalanine, tyrosine, and tryptophan interact with their environments via both hydrophobic and electrostatic interactions. Determining the extent to which these contribute to protein function and stability is not possible with conventional mutagenesis. Serial fluorination of a given aromatic is a validated method in vitro and in silico to specifically alter electrostatic characteristics, but this approach is restricted to a select few experimental systems. Here, we report a new group of pyrrolysine-based aminoacyl-tRNA synthetase/tRNA pairs that enable the site-specific encoding of a varied spectrum of fluorinated phenylalanine amino acids in E. coli and mammalian (HEK 293T) cells. By allowing the cross-kingdom expression of proteins bearing these unnatural amino acids at biochemical scale, these tools will enable deconstruction of biological mechanisms which utilize aromatic-pi interactions in structural and cellular contexts. Statement of Significance The aromatic side-chains of phenylalanine, tyrosine, and tryptophan are crucial for protein function and pharmacology due to their hydrophobic and electrostatic contributions to catalytic centers and ligand-binding pockets. However, few experimental approaches can chemically assess the functional roles of aromatics in cellular environments. The accepted computational method for aromatic interrogation is via serial fluorination, which lacks an experimental correlate in bacterial or mammalian cell systems. We have identified a family of synthetases to encode multiple different types of fluorinated phenylalanine residues in E. coli and HEK cells via nonsense suppression. The efficiency of these synthetases is sufficient to support biochemical characterization and structural determination of proteins with site-specific incorporation of unnatural phenylalanine analogs.