Abstract Background Bacteria have evolved over billions of years to survive in a wide range of environments. Currently, there is an incomplete understanding of the genetic basis for mechanisms underpinning survival in stressful conditions, such as the presence of anti-microbials. Transposon mutagenesis has been proven to be a powerful tool to identify genes and networks which are involved in survival and fitness under a given condition by simultaneously assaying the fitness of millions of mutants, thereby relating genotype to phenotype and contributing to an understanding of bacterial cell biology. A recent refinement of this approach allows the roles of essential genes in conditional stress survival to be inferred by altering their expression. These advancements combined with the rapidly falling costs of sequencing now allows comparisons between multiple experiments to identify commonalities in stress responses to different conditions. This capacity however poses a new challenge for analysis of multiple data sets in conjunction. Results To address this analysis need, we have developed ‘AlbaTraDIS’; a software application for rapid large-scale comparative analysis of TraDIS experiments that predicts the impact of transposon insertions on nearby genes. AlbaTraDIS can identify genes which are up or down regulated, or inactivated, between multiple conditions, producing a filtered list of genes for further experimental validation as well as several accompanying data visualisations. We demonstrate the utility of our new approach by applying it to identify genes used by Escherichia coli to survive in a wide range of different concentrations of the biocide Triclosan. AlbaTraDIS automatically identified all well characterised Triclosan resistance genes, including the primary target, fabI . A number of new loci were also implicated in Triclosan resistance and the predicted phenotypes for a selection of these were validated experimentally and results showed high consistency with predictions. Conclusions AlbaTraDIS provides a simple and rapid method to analyse multiple transposon mutagenesis data sets allowing this technology to be used at large scale. To our knowledge this is the only tool currently available that can perform these tasks. AlbaTraDIS is written in Python 3 and is available under the open source licence GNU GPL 3 from https://github.com/quadram-institute-bioscience/albatradis .

Abstract Single-cell DNA sequencing has the potential to reveal detailed hierarchical structures in evolving populations of cells. Single cell approaches are increasingly used to study clonal evolution in human ageing and cancer, but have not yet been deployed to study evolving microbial populations. Here, we present an approach for single bacterial genomic analysis using FACS isolation of individual bacteria followed by whole-genome amplification and sequencing. We apply this to in vitro experimental evolution of a hypermutator strain of Salmonella in response to antibiotic stress (ciprofloxacin). By analysing sequence polymorphisms in individual cells from the population we identified the presence and prevalence of sub-populations which have acquired polymorphisms in genes previously demonstrated to be associated with ciprofloxacin susceptibility. We were also able to identify that the population exposed to antibiotic stress was able to both develop resistance whilst maintaining diversity. This population structure could not be resolved from bulk sequence data, and our results show how high-throughput single-cell sequencing can enhance experimental studies of bacterial evolution.

Pseudomonas aeruginosa is a multidrug-resistant opportunistic human pathogen. Chronic infections are associated with biofilms, conferring resistance to antibiotics and complicating treatment strategies. This study focuses on understanding the role of the uncharacterized gene PA3049, upregulated under biofilm conditions. In the context of P. aeruginosa biofilms, PA3049 plays a role in withstanding antimicrobial challenges both in vitro and in clinically validated infection models. Under sub-inhibitory concentrations of antibiotics, the deletion of PA3049 resulted in reduced pyocyanin production and altered abundance of enzymes controlling denitrification, pyoverdine, and hydrogen cyanide biosynthesis. Notably, PA3049 directly interacts with two kinases implicated in stress response, inactivating their active sites. Renamed as the Biofilm antibiotic tolerance Regulator (BatR), PA3049 is a key player in P. aeruginosa biofilm maintenance and antimicrobial tolerance.

Abstract The COVID-19 pandemic has spread to almost every country in the world since it started in China in late 2019. Controlling the pandemic requires a multifaceted approach including whole genome sequencing to support public health interventions at local and national levels. One of the most widely used methods for sequencing is the ARTIC protocol, a tiling PCR approach followed by Oxford Nanopore sequencing (ONT) of up to 96 samples at a time. There is a need, however, for a flexible, platform agnostic, method that can provide multiple throughput options depending on changing requirements as the pandemic peaks and troughs. Here we present CoronaHiT, a method capable of multiplexing up to 96 small genomes on a single MinION flowcell or >384 genomes on Illumina NextSeq, using transposase mediated addition of adapters and PCR based addition of barcodes to ARTIC PCR products. We demonstrate the method by sequencing 95 and 59 SARS-CoV-2 genomes for routine and rapid outbreak response runs, respectively, on Nanopore and Illumina platforms and compare to the standard ARTIC LoCost nanopore method. Of the 154 samples sequenced using the three approaches, genomes with ≥ 90% coverage (GISAID criteria) were generated for 64.3% of samples for ARTIC LoCost, 71.4% for CoronaHiT-ONT, and 76.6% for CoronaHiT-Illumina and have almost identical clustering on a maximum likelihood tree. In conclusion, we demonstrate that CoronaHiT can multiplex up to 96 SARS-CoV-2 genomes per MinION flowcell and that Illumina sequencing can be performed on the same libraries, which will allow significantly higher throughput. CoronaHiT provides increased coverage for higher Ct samples, thereby increasing the number of high quality genomes that pass the GISAID QC threshold. This protocol will aid the rapid expansion of SARS-CoV-2 genome sequencing globally, to help control the pandemic.

The mechanisms by which antimicrobials exert inhibitory effects against bacterial cells and by which bacteria display resistance vary under different conditions. Our understanding of the full complement of genes which can influence sensitivity to many antimicrobials is limited and often informed by experiments completed in a small set of exposure conditions. Capturing a broader suite of genes which contribute to survival under antimicrobial stress will improve our understanding of how antimicrobials work and how resistance can evolve. Here, we apply a new version of "TraDIS" (Transposon Directed Insert Sequencing); a massively parallel transposon mutagenesis approach to identify different responses to the common biocide triclosan across a 125-fold range of concentrations. We have developed a new bioinformatic tool "AlbaTraDIS" allowing both predictions of the impacts of individual transposon inserts on gene function to be made and comparisons across multiple TraDIS data sets. This new TraDIS approach allows essential genes as well as non-essential genes to be assayed for their contribution to bacterial survival and growth by modulating their expression. Our results demonstrate that different sets of genes are involved in survival following exposure to triclosan under a wide range of concentrations spanning bacteriostatic to bactericidal. The identified genes include those previously reported to have a role in triclosan resistance as well as a new set of genes not previously implicated in triclosan sensitivity. Amongst these novel genes are those involved in barrier function, small molecule uptake and integrity of transcription and translation. These data provide new insights into potential routes of triclosan entry and bactericidal mechanisms of action. Our data also helps to put recent work which has demonstrated the ubiquitous nature of triclosan in people and the built environment into context in terms of how different triclosan exposures may influence evolution of bacteria. We anticipate the approach we show here that allows comparisons across multiple experimental conditions of TraDIS data will be a starting point for future work examining how different drug conditions impact bacterial survival mechanisms.

As numbers of bacterial isolates resistant to first line antibiotics rise there has been a revival in the use of older drugs such as fosfomycin. Fosfomycin is a cell wall inhibitor with a unique mode of action, increasingly used in the treatment of urinary tract infections. In this study, the prevalence of fosfomycin resistant E. coli in a panel of 1000 urine isolates was investigated. Three different clinically used fosfomycin susceptibility testing methods were assessed and genome sequencing used to characterise resistant isolates. Of the 1000 isolates, 676 were E. coli of which initial susceptibility testing with the MAST Uri system suggested 81 (12%) were fosfomycin resistant. Of these, 62 were subsequently confirmed as being E. coli. However, using micro-broth dilution, agar dilution and E-test strips, a lower rate of 1.3% (8/62) of E. coli isolates were robustly identified as being truly fosfomycin resistant; a prevalence comparable with other similar studies. The use of E-test and 96-well breakpoint plates gave results that were inconsistent and hard to interpret. Resistant isolates of E. coli belonged to diverse MLST types and each had a unique set of chromosomal alterations in genes associated with fosfomycin resistance. Changes in GlpT and UhpT/UhpA transport systems were commonly identified, with 6/8 of the resistant isolates possessing amino-acid changes or deletions absent in susceptible strains. Fosfomycin resistant isolates were not multiply drug resistance and did not carry plasmidic fosfomycin resistance genes. Therefore, the use of fosfomycin may be unlikely to drive selection of a particular clone or movement of transferrable resistance genes. Fosfomycin remains a viable option for the treatment of E. coli in uncomplicated UTIs, different susceptibility testing platforms can give very different results regarding the prevalence of fosfomycin resistance with false positives a potential problem that may unnecessarily limit use of this agent.

Abstract The human skin microbiome represents a variety of complex microbial ecosystems that play a key role in host health. Molecular methods to study these communities have been developed but have been largely limited to low-throughput quantification and short amplicon sequencing, providing limited functional information about the communities present. Shotgun metagenomic sequencing has emerged as a preferred method for microbiome studies as it provides more comprehensive information about the species/strains present in a niche and the genes they encode. However, the relatively low bacterial biomass of skin, in comparison to other areas such as the gut microbiome, makes obtaining sufficient DNA for shotgun metagenomic sequencing challenging. Here we describe an optimised high-throughput method for extraction of high molecular weight DNA suitable for shotgun metagenomic sequencing. We validated the performance of the extraction method, and analysis pipeline on skin swabs collected from both adults and babies. The pipeline effectively characterised the bacterial skin microbiota with a cost and throughput suitable for larger longitudinal sets of samples. Application of this method will allow greater insights into community compositions and functional capabilities of the skin microbiome. Impact Statement Determining the functional capabilities of microbial communities within different human microbiomes is important to understand their impacts on health. Extraction of sufficient DNA is challenging, especially from low biomass samples, such as skin swabs suitable for shotgun metagenomics, which is needed for taxonomic resolution and functional information. Here we describe an optimised DNA extraction method that produces enough DNA from skin swabs, suitable for shotgun metagenomics, and demonstrate it can be used to effectively characterise the skin microbiota. This method will allow future studies to identify taxonomic and functional changes in the skin microbiota which is needed to develop interventions to improve and maintain skin health. Data Summary All sequence data and codes can be accessed at: NCBI Bio Project ID: PRJNA937622 DOI: https://github.com/quadram-institute-bioscience/coronahit_guppy DOI: https://github.com/ilianaserghiou/Serghiou-et-al.-2023-Codes

ABSTRACT Bacteriophages (phages) within the Przondovirus genus are T7-like podoviruses belonging to the Studiervirinae subfamily, within the Autographiviridae family and have a highly conserved genome organisation. The genome size of these phages ranges from 37 kb to 42 kb, encode 50-60 genes and are characterised by the presence of direct terminal repeats (DTRs) flanking the linear chromosome. These DTRs are often deleted during short-read-only and hybrid assemblies. Moreover, long-read-only assemblies are often littered with sequencing and/or assembly errors and require additional curation. Here, we present the isolation and characterisation of ten novel przondoviruses targeting Klebsiella spp. We describe HYPPA – a HY brid and P oly-polish P hage A ssembly workflow, which utilises long-read assemblies in combination with short-read sequencing to resolve phage DTRs and correcting errors, negating the need for laborious primer walking and Sanger sequencing validation. Our data demonstrate the importance of careful curation of phage assemblies before publication, and prior to using them for comparative genomics. IMPACT STATEMENT The current workflows employed for phage genome assembly are often error-prone and can lead to many incomplete phage genomes being deposited within databases. This can create challenges when performing comparative genomics, and may also lead to incorrect taxonomic assignment. To overcome these challenges we proposed HYPPA, a workflow that can produce complete and high-quality phage genomes without the need for laborious lab-based validation. DATA SUMMARY Phage raw reads are available from the National Centre for Biotechnology Information Sequence Read Archive (NCBI-SRA) under the BioProject number PRJNA914245. Phage annotated genomes have been deposited at GenBank under the accessions OQ579023 - OQ579032 ( Table 1 ). Bacterial WGS data for clinical preterm infant samples have been deposited at GenBank under BioProject accession PRJNA471164 ( Table S1 ). Bacterial raw reads for food samples are available from NCBI-SRA with individual accessions (SAMN33593347-SAMN33593351), and can be found under the BioProject number PRJNA941224 ( Table S1 ). Strain-specific details for bacteria and publicly-available phages used in these analyses, along with accessions for the latter can be found in Table S1 and Table S6 , respectively. The CL1-CL8 clinical Klebsiella strains ( Table S1 ) were under a Materials Transfer Agreement, for which sequencing data and strain information is not available.

Abstract Piperacillin-Tazobactam is a β-lactam/β-lactamase inhibitor combination which is amongst the most prescribed antimicrobials in hospital medicine. Piperacillin is inactivated by commonly carried resistance enzymes, but tazobactam inhibits these allowing successful treatment. The effect of piperacillin on Gram-negative bacteria has been widely studied, but less attention has been paid to the effects of tazobactam. We used a massive transposon mutagenesis approach (TraDIS- Xpress ) to determine the genes in Escherichia coli that affect survival when exposed to piperacillin and tazobactam, separately and together. We found significant differences in the selective pressure of the two drugs: a striking finding was that multiple efflux pump families and regulators were essential for survival in the presence of tazobactam, but only one efflux system was beneficial for piperacillin. Additionally, we identified the shikimate kinase AroK as a potential target for tazobactam. This method also found that genes involved in DNA replication and repair reduced E. coli susceptibility to a combination of piperacillin and tazobactam, not seen from either drug treatment alone. Treatment of E. coli and Klebsiella pneumoniae with piperacillin and/or tazobactam selected for mutants with reduced susceptibility, and SNP analyses supported the TraDIS- Xpress findings that tazobactam selects for changes in membrane permeability and maintenance associated with multidrug-resistance. Increased efflux activity is an important foundation of multidrug resistance in human pathogens, therefore the finding that tazobactam can select for this is concerning. These findings could have consequences for antibiotic prescription and should inform the development of future β-lactamase inhibitors to reduce the global increase in multidrug-resistant infections.

Abstract The development of novel antimicrobials provides additional treatment options for infectious diseases, including antimicrobial resistant infections. There are many hurdles to antimicrobial development and identifying an antimicrobial’s mechanism of action is a crucial step in progressing candidate molecules through the drug discovery pipeline. We used the genome wide screening method TraDIS- Xpress to identify genes in two model Gram-negative bacteria that affected sensitivity to three analogues of a novel antimicrobial compound (OPT-2U1). TraDIS- Xpress identified that all three analogues targeted the lipid IV A biosynthetic pathway in E. coli and Salmonella Typhimurium. Specifically, we determined that the antimicrobial target was likely to be LpxD, and validated this by finding a 5 log 2 -fold increase in the MIC of the OPT-2U1 analogues in E. coli when lpxD was overexpressed. Synergies were identified between OPT-2U1 analogues combined with rifampicin or colistin, to varying strengths, in both E. coli and S . Typhimurium. LPS composition was a likely reason for differences between E. coli and S.Typhimurium, as perturbation of LPS synthesis affected synergy between antibiotics and OPT-2U1 analogues. Finally, genes involved in ATP synthesis and membrane signalling functions were also found to affect the synergy between colistin and OPT-2U1 analogues. TraDIS- Xpress has proven a powerful tool to rapidly assay all genes (and notably, essential genes) within a bacterium for roles in dictating antimicrobial sensitivity. This study has confirmed the predicted target pathway of OPT-2U1 and identified synergies which could be investigated for development of novel antimicrobial formulations. Data Summary Nucleotide sequence data supporting the analysis in this study has been deposited in ArrayExpress under the accession number E-MTAB-13250. The authors confirm all supporting data, code and protocols have been provided within the article or through supplementary data files.