During apoptosis, the mitochondrial outer membrane is permeabilized, leading to the release of cytochrome c that activates downstream caspases. Mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP) has historically been thought to occur synchronously and completely throughout a cell, leading to rapid caspase activation and apoptosis. Using a new imaging approach, we demonstrate that MOMP is not an all-or-nothing event. Rather, we find that a minority of mitochondria can undergo MOMP in a stress-regulated manner, a phenomenon we term “minority MOMP.” Crucially, minority MOMP leads to limited caspase activation, which is insufficient to trigger cell death. Instead, this caspase activity leads to DNA damage that, in turn, promotes genomic instability, cellular transformation, and tumorigenesis. Our data demonstrate that, in contrast to its well-established tumor suppressor function, apoptosis also has oncogenic potential that is regulated by the extent of MOMP. These findings have important implications for oncogenesis following either physiological or therapeutic engagement of apoptosis.

Article26 July 2018Open Access Source DataTransparent process Mitochondrial inner membrane permeabilisation enables mtDNA release during apoptosis Joel S Riley Joel S Riley orcid.org/0000-0001-9170-5716 Cancer Research UK Beatson Institute, Glasgow, UK Institute of Cancer Sciences, University of Glasgow, Glasgow, UK Search for more papers by this author Giovanni Quarato Giovanni Quarato orcid.org/0000-0003-1167-3422 Department of Immunology, St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, TN, USA Search for more papers by this author Catherine Cloix Catherine Cloix Cancer Research UK Beatson Institute, Glasgow, UK Institute of Cancer Sciences, University of Glasgow, Glasgow, UK Search for more papers by this author Jonathan Lopez Jonathan Lopez orcid.org/0000-0003-3768-2378 Cancer Research UK Beatson Institute, Glasgow, UK Institute of Cancer Sciences, University of Glasgow, Glasgow, UK Search for more papers by this author Jim O'Prey Jim O'Prey Cancer Research UK Beatson Institute, Glasgow, UK Institute of Cancer Sciences, University of Glasgow, Glasgow, UK Search for more papers by this author Matthew Pearson Matthew Pearson MRC Human Genetics Unit, MRC Institute of Genetics and Molecular Medicine, The University of Edinburgh, Edinburgh, UK Search for more papers by this author James Chapman James Chapman Ageing Research Laboratories, Newcastle University Institute for Ageing, LLHW Centre for Ageing and Vitality, Campus for Ageing and Vitality, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, UK Search for more papers by this author Hiromi Sesaki Hiromi Sesaki Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA Search for more papers by this author Leo M Carlin Leo M Carlin orcid.org/0000-0001-7172-5234 Cancer Research UK Beatson Institute, Glasgow, UK Institute of Cancer Sciences, University of Glasgow, Glasgow, UK Search for more papers by this author João F Passos João F Passos Ageing Research Laboratories, Newcastle University Institute for Ageing, LLHW Centre for Ageing and Vitality, Campus for Ageing and Vitality, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, UK Institute for Cell and Molecular Biosciences, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, UK Search for more papers by this author Ann P Wheeler Ann P Wheeler MRC Human Genetics Unit, MRC Institute of Genetics and Molecular Medicine, The University of Edinburgh, Edinburgh, UK Search for more papers by this author Andrew Oberst Andrew Oberst Department of Immunology, University of Washington, Seattle, WA, USA Center for Innate Immunity and Immune Disease, University of Washington, Seattle, WA, USA Search for more papers by this author Kevin M Ryan Kevin M Ryan Cancer Research UK Beatson Institute, Glasgow, UK Institute of Cancer Sciences, University of Glasgow, Glasgow, UK Search for more papers by this author Stephen WG Tait Corresponding Author Stephen WG Tait [email protected] orcid.org/0000-0001-7697-132X Cancer Research UK Beatson Institute, Glasgow, UK Institute of Cancer Sciences, University of Glasgow, Glasgow, UK Search for more papers by this author Joel S Riley Joel S Riley orcid.org/0000-0001-9170-5716 Cancer Research UK Beatson Institute, Glasgow, UK Institute of Cancer Sciences, University of Glasgow, Glasgow, UK Search for more papers by this author Giovanni Quarato Giovanni Quarato orcid.org/0000-0003-1167-3422 Department of Immunology, St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, TN, USA Search for more papers by this author Catherine Cloix Catherine Cloix Cancer Research UK Beatson Institute, Glasgow, UK Institute of Cancer Sciences, University of Glasgow, Glasgow, UK Search for more papers by this author Jonathan Lopez Jonathan Lopez orcid.org/0000-0003-3768-2378 Cancer Research UK Beatson Institute, Glasgow, UK Institute of Cancer Sciences, University of Glasgow, Glasgow, UK Search for more papers by this author Jim O'Prey Jim O'Prey Cancer Research UK Beatson Institute, Glasgow, UK Institute of Cancer Sciences, University of Glasgow, Glasgow, UK Search for more papers by this author Matthew Pearson Matthew Pearson MRC Human Genetics Unit, MRC Institute of Genetics and Molecular Medicine, The University of Edinburgh, Edinburgh, UK Search for more papers by this author James Chapman James Chapman Ageing Research Laboratories, Newcastle University Institute for Ageing, LLHW Centre for Ageing and Vitality, Campus for Ageing and Vitality, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, UK Search for more papers by this author Hiromi Sesaki Hiromi Sesaki Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA Search for more papers by this author Leo M Carlin Leo M Carlin orcid.org/0000-0001-7172-5234 Cancer Research UK Beatson Institute, Glasgow, UK Institute of Cancer Sciences, University of Glasgow, Glasgow, UK Search for more papers by this author João F Passos João F Passos Ageing Research Laboratories, Newcastle University Institute for Ageing, LLHW Centre for Ageing and Vitality, Campus for Ageing and Vitality, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, UK Institute for Cell and Molecular Biosciences, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, UK Search for more papers by this author Ann P Wheeler Ann P Wheeler MRC Human Genetics Unit, MRC Institute of Genetics and Molecular Medicine, The University of Edinburgh, Edinburgh, UK Search for more papers by this author Andrew Oberst Andrew Oberst Department of Immunology, University of Washington, Seattle, WA, USA Center for Innate Immunity and Immune Disease, University of Washington, Seattle, WA, USA Search for more papers by this author Kevin M Ryan Kevin M Ryan Cancer Research UK Beatson Institute, Glasgow, UK Institute of Cancer Sciences, University of Glasgow, Glasgow, UK Search for more papers by this author Stephen WG Tait Corresponding Author Stephen WG Tait [email protected] orcid.org/0000-0001-7697-132X Cancer Research UK Beatson Institute, Glasgow, UK Institute of Cancer Sciences, University of Glasgow, Glasgow, UK Search for more papers by this author Author Information Joel S Riley1,2, Giovanni Quarato3, Catherine Cloix1,2, Jonathan Lopez1,2,10, Jim O'Prey1,2, Matthew Pearson4, James Chapman5, Hiromi Sesaki6, Leo M Carlin1,2, João F Passos5,7, Ann P Wheeler4, Andrew Oberst8,9, Kevin M Ryan1,2 and Stephen WG Tait *,1,2 1Cancer Research UK Beatson Institute, Glasgow, UK 2Institute of Cancer Sciences, University of Glasgow, Glasgow, UK 3Department of Immunology, St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, TN, USA 4MRC Human Genetics Unit, MRC Institute of Genetics and Molecular Medicine, The University of Edinburgh, Edinburgh, UK 5Ageing Research Laboratories, Newcastle University Institute for Ageing, LLHW Centre for Ageing and Vitality, Campus for Ageing and Vitality, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, UK 6Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA 7Institute for Cell and Molecular Biosciences, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, UK 8Department of Immunology, University of Washington, Seattle, WA, USA 9Center for Innate Immunity and Immune Disease, University of Washington, Seattle, WA, USA 10Present address: UMR INSERM 1052 CNRS 5286, Cancer Research Centre of Lyon (CRCL), Léon Bérard Centre, University of Lyon, Lyon, France *Corresponding author. Tel: +44 1413 308703; E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2018)37:e99238https://doi.org/10.15252/embj.201899238 See also: K Cosentino & AJ García-Sáez (September 2018) PDFDownload PDF of article text and main figures. Peer ReviewDownload a summary of the editorial decision process including editorial decision letters, reviewer comments and author responses to feedback. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Abstract During apoptosis, pro-apoptotic BAX and BAK are activated, causing mitochondrial outer membrane permeabilisation (MOMP), caspase activation and cell death. However, even in the absence of caspase activity, cells usually die following MOMP. Such caspase-independent cell death is accompanied by inflammation that requires mitochondrial DNA (mtDNA) activation of cGAS-STING signalling. Because the mitochondrial inner membrane is thought to remain intact during apoptosis, we sought to address how matrix mtDNA could activate the cytosolic cGAS-STING signalling pathway. Using super-resolution imaging, we show that mtDNA is efficiently released from mitochondria following MOMP. In a temporal manner, we find that following MOMP, BAX/BAK-mediated mitochondrial outer membrane pores gradually widen. This allows extrusion of the mitochondrial inner membrane into the cytosol whereupon it permeablises allowing mtDNA release. Our data demonstrate that mitochondrial inner membrane permeabilisation (MIMP) can occur during cell death following BAX/BAK-dependent MOMP. Importantly, by enabling the cytosolic release of mtDNA, inner membrane permeabilisation underpins the immunogenic effects of caspase-independent cell death. Synopsis BAX/BAK pore formation ruptures the outer mitochondrial membrane in apoptotic cells while the inner membrane was thought to remain intact. New data show that permeabilisation of the mitochondrial inner membrane induces mitochondrial DNA release and signaling via cytosolic cGAS-STING. Apoptotic mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP) induces widening pores in the mitochondrial outer membrane in a BAX/BAK-dependent manner. Mitochondrial inner membrane is extruded through widening BAX pores. Mitochondrial inner membrane permeabilization (MIMP) enables mtDNA release into the cytoplasm and activation of the cGAS-STING signaling pathway. Introduction To initiate cell death, intrinsic or mitochondrial apoptosis requires mitochondrial outer membrane permeabilisation, or MOMP (Tait & Green, 2013). MOMP causes the release of mitochondrial intermembrane space proteins, including cytochrome c, that activate caspase proteases leading to apoptosis. Nevertheless, irrespective of caspase activity, cells typically do not survive following widespread MOMP, defining it as a point-of-no-return (Haraguchi et al, 2000; Ekert et al, 2004; Tait et al, 2010). Because of this central role in dictating cell fate, MOMP is tightly controlled, primarily via pro- and anti-apoptotic members of the BCL-2 protein family (Lopez & Tait, 2015). Under homeostatic conditions, anti-apoptotic BCL-2 family members (e.g. BCL-2, BCL-xL, MCL-1) block the pro-apoptotic actions of BAX and BAK. Following an apoptotic trigger, BAX and BAK are activated, leading to their oligomerisation in the mitochondrial outer membrane and MOMP (Wei et al, 2001; Cosentino & Garcia-Saez, 2017). Mitochondrial apoptosis is considered a non-inflammatory form of cell death, allowing the host to quickly and efficiently clear away dead cell corpses without provoking an immune response (Arandjelovic & Ravichandran, 2015). Recently, others and ourselves have shown that caspase activity is essential for the non-inflammatory nature of mitochondrial apoptosis; if caspase activity is blocked following MOMP, cell death still occurs, but a type I interferon (IFN) response and NF-κB activation ensues (Rongvaux et al, 2014; White et al, 2014; Giampazolias et al, 2017). This leads to pro-inflammatory cytokine production and an immune response towards the dying cell that can initiate anti-tumour immunity (Giampazolias et al, 2017). Therefore, as proposed by others, a main function of apoptotic caspase activity may be to silence inflammation during cell death (Martin et al, 2012). The ability of MOMP to activate inflammation and a type I IFN response requires recognition of mtDNA by the cytosolic cGAS-STING DNA sensing pathway (Rongvaux et al, 2014; White et al, 2014; Giampazolias et al, 2017). However, it is challenging to reconcile how matrix localised mtDNA can activate the cytosolic cGAS-STING DNA sensing pathway since the mitochondrial inner membrane is thought to remain intact during apoptosis (von Ahsen et al, 2000; Waterhouse et al, 2001). Given this paradox, we set out to define how mtDNA could activate cGAS-STING signalling. Using a variety of high-resolution imaging techniques, we find that following the onset of MOMP, BAX/BAK-mediated pores widen to allow the extrusion of newly unstructured inner membrane. Under conditions of caspase inhibition, the extruded inner membrane permeabilises facilitating mtDNA release into the cytoplasm, allowing it to activate cGAS-STING signalling and IFN synthesis. Unexpectedly, our data demonstrate that the mitochondrial inner membrane can undergo permeabilisation during cell death. Importantly, by releasing mtDNA, mitochondrial inner membrane permeabilisation, or MIMP, enables cell death-associated inflammation. Results mtDNA is released from mitochondria following MOMP To visualise mtDNA dynamics during apoptosis, we used super-resolution Airyscan confocal microscopy. Importantly, this provides sufficient resolution to allow the visualisation of the mitochondrial outer membrane and matrix-resident molecules (such as TFAM containing mtDNA nucleoids) as distinct entities under sub-diffraction-limiting conditions. As expected, in healthy U2OS cells, dual immunostaining of the mitochondria outer membrane protein TOM20 and DNA revealed that mtDNA nucleoids are contained within mitochondria surrounded by a continuous outer membrane (Fig 1A). To engage mitochondrial apoptosis, U2OS cells were treated with the BH3-mimetic ABT-737, which inhibits BCL-xL, BCL-2 and BCL-w (Oltersdorf et al, 2005) together with actinomycin D (ActD, to inhibit transcription of labile MCL-1), in the presence or absence of pan-caspase inhibitor qVD-OPh. To assess cell viability, U2OS cells were imaged using IncuCyte live-cell imaging and SYTOX Green uptake or assessed for long-term clonogenic survival (Fig EV1A and B). Consistent with engagement of mitochondrial apoptosis, ABT-737/ActD co-treatment rapidly and synchronously induced cell death (Fig EV1A). Co-treatment with caspase inhibitor qVD-OPh prevented cell death in the short term (Fig EV1A) but failed to allow long-term clonogenic survival (Fig EV1B), consistent with widespread MOMP being a point-of-no-return. Under identical MOMP-inducing conditions, U2OS cells were immunostained with anti-TOM20 and DNA antibodies to visualise mitochondrial outer membrane integrity and mtDNA-containing nucleoids, respectively (Fig 1B). Alternatively, U2OS cells were immunostained with anti-TOM20 and cytochrome c antibodies to determine MOMP (Fig EV1C and D). Under these conditions, over 90% of U2OS cells underwent MOMP, as determined by loss of mitochondrial cytochrome c staining (Fig EV1C and D). Specifically following ABT-737/ActD treatment, under caspase-inhibited conditions, permeabilisation of the mitochondrial outer membrane was observed in over 80% of cells, as evidenced by discontinuous, crescent-like TOM20 immunostaining (Fig 1B and C). Strikingly, mtDNA displayed cytosolic re-localisation in cells that had undergone MOMP under caspase-inhibited conditions (Fig 1B). Under these conditions, over 80% of cells displayed mtDNA cytosolic release (Fig 1C) and, on average per cell, over 80% of mtDNA displayed cytosolic localisation (Fig 1D). A similar pattern of mtDNA cytosolic localisation and mitochondrial outer membrane permeabilisation was also observed in E1A/Ras transformed MEF specifically following ABT-737/ActD/qVD-OPh treatment (Fig 1E). Both cytosolic and mitochondrial mtDNA structures were of similar size, suggesting cytosolic re-localisation of mtDNA-containing nucleoids. To determine whether mtDNA re-localisation was dependent on MOMP, we used CRISPR-Cas9 genome editing to delete BAX and BAK, two proteins essential for MOMP (Wei et al, 2001) either singly or together (Fig 1F). Only combined deletion of BAX and BAK in U2OS cells prevented MOMP and cell death following ABT-737/S63845 treatment (Figs 1G and EV1E). Under identical conditions, dual immunostaining of TOM20 and DNA demonstrated that combined deletion of BAX/BAK, but not of either alone, prevented cytosolic release of mtDNA following ABT-737/S63845/qVD-OPh treatment (Fig 1H and I). Collectively, these data show that matrix localised mtDNA is released from mitochondria following BAX/BAK-dependent MOMP under caspase-inhibited conditions. Figure 1. mtDNA is released from mitochondria following MOMP in a BAX/BAK-dependent manner Fixed super-resolution Airyscan images of U2OS cells immunostained with anti-TOM20 (green) and anti-DNA (red) antibodies. Scale bar = 10 μm. Representative images from three independent experiments. Airyscan images of U2OS cells treated with 10 μM ABT-737, 1 μM ActD and 20 μM qVD-OPh for 3 h, immunostained with anti-TOM20 and anti-DNA antibodies. Scale bar = 10 μm. Representative images from three independent experiments. Quantification of cells exhibiting > 10% mtDNA release following treatment with 10 μM ABT-737, 1 μM ActD and 20 μM qVD-OPh. Data are expressed as mean ± SD from three independent experiments and analysed by Student's t-test. Quantification of the extent of mitochondrial DNA (mtDNA) nucleoid release per cell following treatment with 10 μM ABT-737, 1 μM ActD and 20 μM qVD-OPh. Data are expressed as mean ± SD from two independent experiments and analysed by Student's t-test. Airyscan images of MEF cells untreated or treated with 10 μM ABT-737 and 20 μM qVD-OPh for 3 h, immunostained with anti-TOM20 and anti-DNA antibodies. Scale bar = 10 μm. Representative images from three independent experiments. BAX and BAK expression levels in U2OS cells with CRISPR-Cas9-mediated deletion of BAX, BAK or BAX/BAK. U2OS cells with BAX, BAK or BAX/BAK deletion by CRISPR-Cas9 treated with 10 μM ABT-737 and 2 μM S63845 and analysed for cell viability using an IncuCyte live-cell imager and SYTOX Green exclusion. Data are expressed as mean ± SEM, representative of three independent experiments, and have been normalised to starting confluency. Airyscan images of U2OS (i) control cells or with CRISPR-Cas9-mediated deletion of either (ii) BAX, (iii) BAK or (iv) BAX and BAK treated with 10 μM ABT-737, 2 μM S63845 and 20 μM qVD-OPh for 3 h. Scale bar = 10 μm. Representative images from three independent experiments. Quantification of mtDNA nucleoid release per cell in U2OS EMPTYCRISPR, BAXCRISPR, BAKCRISPR and BAX/BAKCRISPR cells. Data are expressed as mean ± SD from three independent experiments and analysed using Student's t-test. Source data are available online for this figure. Source Data for Figure 1 [embj201899238-sup-0012-SDataFig1.pdf] Download figure Download PowerPoint Click here to expand this figure. Figure EV1. BAX/BAK-dependent MOMP commits cells to die U2OS cells treated with 10 μM ABT-737 and 1 μM ActD ± 20 μM qVD-OPh. Cell viability was analysed using an IncuCyte live-cell imager and SYTOX Green exclusion. Data are expressed as mean ± SEM, representative of three independent experiments. Clonogenic survival assay of U2OS cells treated with 10 μM ABT-737 and 2 μM S63845 ± 20 μM qVD-OPh or 10 μM ABT-737 and 1 μM ActD ± 20 μM qVD-OPh. Representative images from three independent experiments. Airyscan images of U2OS cells treated with 10 μM ABT-737, 1 μM ActD and 20 μM qVD-OPh for 3 h, immunostained with anti-TOM20 (green) and anti-cytochrome c (red). Scale bar = 10 μm. Representative images from three independent experiments. Quantification of cytochrome c release from mitochondria. Data are expressed as mean ± SD from three independent experiments and analysed using Student's t-test. Quantification of cytochrome c release from BAX-, BAK-, and BAX/BAK-deleted cells. Data are expressed as mean ± SD from three independent experiments and analysed using Student's t-test. Source data are available online for this figure. Download figure Download PowerPoint Mitochondrial release of mtDNA correlates with a STING-dependent interferon response We next investigated an association between mitochondrial mtDNA release and activation of a STING-dependent interferon response. For this purpose, we used SVEC 4–10 murine endothelial cells, which we have previously shown have an intact cGAS-STING signalling pathway (Giampazolias et al, 2017). To induce rapid mitochondrial apoptosis, SVEC cells were treated with ABT-737 together with the MCL-1 inhibitor S63845 (Kotschy et al, 2016), and cell death was monitored by SYTOX Green uptake and IncuCyte live-cell imaging (Fig 2A). Combined ABT-737/S63845 treatment led to rapid cell death that was inhibited by addition of qVD-OPh, consistent with engagement of mitochondrial apoptosis. Following 3 h of ABT-737/S63845 treatment in the presence of qVD-OPh, cells were immunostained with anti-TOM20 and DNA antibodies to visualise mitochondrial outer membrane integrity and mtDNA-containing nucleoids (Fig 2B). Similar to other cell types, mitochondrial release of mtDNA was detected. We next investigated whether a STING-dependent transcriptional interferon response was being activated under these conditions using qRT–PCR. Following engagement of caspase-independent cell death (CICD), various IFN response genes (Ifnb1, Irf7 and Oasl1) were upregulated (Fig 2C). ABT-737/S63845-induced transcriptional upregulation of Ifnb1 was greatly increased upon inhibition of caspase function by qVD-OPh addition (Fig 2D). Deletion of STING, through CRISPR/Cas9 genome editing (Fig 2E), blocked Ifnb1 upregulation during CICD, consistent with previous findings of others and ourselves (Fig 2F; Giampazolias et al, 2017; Rongvaux et al, 2014; White et al, 2014). Combined deletion of BAX and BAK, but not of either alone, also inhibited Ifnb1 upregulation following ABT-737/S63845/qVD-OPh treatment, demonstrating a requirement for MOMP (Fig 2G and H). These data demonstrate a correlation between the release of mtDNA and activation of a STING-dependent interferon response. Figure 2. MOMP-induced mtDNA release initiates a cGAS-STING-dependent type I interferon response SVEC cells treated with 10 μM ABT-737 and 10 μM S63845 ± 20 μM qVD-OPh. Cell viability was analysed using an IncuCyte live-cell imager and SYTOX Green exclusion. Data are expressed as mean ± SEM, representative of two independent experiments. Airyscan images of SVEC cells treated with 10 μM ABT-737, 10 μM S63845 and 20 μM qVD-OPh for 3 h, immunostained with anti-TOM20 and anti-DNA antibodies. Scale bar = 10 μm. Representative images from three independent experiments. Ifnb1, Irf7 and Oasl1 mRNA expression in SVEC cells treated with 10 μM ABT-737, 10 μM S63845 and 20 μM qVD-OPh for 3 h. Data are representative of three independent experiments. Ifnb1 mRNA expression in SVEC cells treated with 10 μM ABT-737, 10 μM S63845 ± 20 μM qVD-OPh for 2 h. Data are representative of two independent experiments. STING expression in CRISPR-Cas9-mediated STING-deleted SVEC cells using three independent sgRNA sequences. Ifnb1 mRNA expression in STING CRISPR-Cas9-deleted SVEC cells treated with 10 μM ABT-737, 10 μM S63845 and 20 μM qVD-OPh for 3 h. Data are representative of two independent experiments. BAX and BAK expression in SVEC cells harbouring CRISPR-Cas9-mediated deletion of BAX, BAK or BAX/BAK. Ifnb1 mRNA expression in BAX, BAK or BAX/BAK CRISPR-Cas9-deleted SVEC cells treated with 10 μM ABT-737, 10 μM S63845 and 20 μM qVD-OPh for 3 h. Data are representative of two independent experiments. Source data are available online for this figure. Source Data for Figure 2 [embj201899238-sup-0013-SDataFig2.pdf] Download figure Download PowerPoint Mitochondrial nucleoids are extruded via expanding outer membrane pores Our data suggests that mtDNA nucleoids are released from mitochondria during following MOMP under caspase-inhibited conditions. To investigate this further, U2OS cells were treated with ABT-737/S63845/qVD-OPh for 3 h to induce CICD, then simultaneously stained for mtDNA and TFAM—a nucleoid-resident protein (Fig 3A). The mitochondrial outer membrane was visualised using a SNAP-tag Omp25 fusion protein and the far-red fluorophore Janelia Fluor 646 (JF646; referred to as JF646-MOM; Grimm et al, 2015; Katajisto et al, 2015). As expected, in healthy mitochondria, DNA co-localised with TFAM within the mitochondria (Fig 3A). Importantly, during CICD, both DNA and TFAM co-localised outside the mitochondria, consistent with release of mtDNA-containing nucleoids. We next investigated the dynamics of mtDNA re-localisation by live-cell imaging. Because live-cell imaging of mtDNA using PicoGreen was not possible due to photobleaching, we monitored the localisation of mClover-fused TFAM. The mitochondrial outer membrane was visualised using JF646-MOM. As expected, TFAM-mScarlet localised to the mitochondrial matrix, co-localising with mtDNA (Fig EV2A). U2OS cells expressing JF646-MOM and TFAM-mClover were induced to undergo MOMP ± qVD-OPh and imaged by live-cell imaging (Fig EV2B, Videos EV1, EV2 and EV3). Under caspase-proficient conditions, following MOMP, the cell rapidly shrunk and detached, consistent with engagement of apoptosis (Video EV1). Under caspase-inhibited conditions, after ABT-737 treatment, TFAM-mClover was released into the cytosol, consistent with our earlier analysis of mtDNA (Fig EV2B, Videos EV2 and EV3). Finally, we investigated the kinetics of TFAM-mClover release and MOM pore widening relative to MOMP. U2OS cells expressing TFAM-mClover, Omi-mCherry and JF646-MOM were treated with ABT-737 in combination with the MCL1 inhibitor S63845 in the presence of qVD-OPh then subject to live-cell imaging (Fig 3B, Video EV4). Analysis of individual mitochondria demonstrated, in a sequential manner, that mitochondrial release of Omi-mCherry (denoting MOMP) occurs prior to the visual appearance and widening of MOM pores (Fig 3C and D), finally followed by TFAM-mClover release. Importantly, not all mitochondria following MOMP released TFAM and, when it did occur, the time between MOMP and release of TFAM was highly variable, ranging from 10 to 100 min (Fig EV2C and D). Figure 3. mtDNA extrusion occurs through expanding outer membrane pores Airyscan images of U2OS cells stably expressing JF646-MOM (magenta) treated with 10 μM ABT-737, 2 μM S63845 and 20 μM qVD-OPh for 3 h, immunostained with anti-DNA and anti-TFAM antibodies. Scale bar = 10 μm. Representative images from two independent experiments. Live-cell Airyscan imaging of U2OS cells stably expressing JF646-MOM (magenta) and Omi-mCherry (red) and transiently expressing TFAM-mClover (green). Cells were treated with 10 μM ABT-737, 10 μM S63845 and 20 μM qVD-OPh at t = 0. Arrows denote mitochondria which show TFAM release. Scale bar = 10 μm. See Video EV4. Numbers indicate time in minutes. Zoom of a single mitochondrion from Fig 3B and Video EV4. Scale bar = 1 μm. Numbers indicate time in minutes. Loss of Omi intensity as assessed by standard deviation of the Omi signal across the cell and pore size plotted against time. Data are from three mitochondria (pore size) or three cells (Omi release) from two independent experiments and are expressed as mean ± SEM. Source data are available online for this figure. Source Data for Figure 3 [embj201899238-sup-0014-SDataFig3.pdf] Download figure Download PowerPoint Click here to expand this figure. Figure EV2. Kinetic analysis of mitochondrial TFAM release Airyscan image of U2OS cells transfected with TFAM-mScarlet and immunostained with anti-TOM20 and anti-DNA antibodies. Scale bar = 10 μm. Representative images from two independent experiments. Live-cell Airyscan imaging of U2OS cells stably expressing JF646-MOM and transiently expressing TFAM-mClover. Cells were treated with 10 μM ABT-737 and 20 μM qVD-OPh at t = 0. Scale bar = 10 μm. See Videos EV2 and EV3. Numbers indicate time in minutes. Arrowheads indicate instances of released TFAM. Quantification of mitochondria which do or do not release TFAM as assessed by eye from live-cell Airyscan imaging, including Fig 3B and Video EV4. Data are from four cells across two independent experiments. Time of Omi release and TFAM released were assessed by eye from live-cell Airyscan imaging, including Fig 3B and Video EV4. Data are from four cells across two independent experiments. Source data are available online for this figure. Download figure Download PowerPoint Mitochondrial inner membrane permeabilisation allows mtDNA release into the cytosol Thus far, our data demonstrate that mtDNA/TFAM complexes relocalise beyond the mitochondrial outer membrane; however, the integrity of the inner mitochondrial membrane (IMM) or localisation of mtDNA relative to the IMM was not determined. To investigate this, U2OS cells were treated with ABT-737/ActD in the presence of qVD-OPh, immunostained for apoptosis-inducing factor (AIF) and DNA (to visualise the IMM and mtDNA, respectively) and analysed by Airyscan imaging (Fig 4A, Videos EV5 and EV6). In healthy cells, the majority of mtDNA signal was within AIF immunostained structures, in line with AIF being inner membrane localised and mtDNA residing within the matrix (Fig 4A, Video EV5). Importantly, following MOMP (ABT-737/ActD/qVD-OPh treatment), mtDNA was found to localise in the cytoplasm, outside the inner membrane (AIF immunostained structures; Fig 4A, Video EV6). This suggests that mtDNA can pass beyond the inner membrane during caspase-independent cell death (CICD). To investigate this further, we simultaneously imaged the MOM, IMM and mtDNA during cell death. U2OS cells stably expressing JF646-MOM were treated with ABT-737/ActD/qVD-OPh and then im

Mitophagy is an evolutionarily conserved process that selectively targets impaired mitochondria for degradation. Defects in mitophagy are often associated with diverse pathologies, including cancer. Because the main known regulators of mitophagy are frequently inactivated in cancer cells, the mechanisms that regulate mitophagy in cancer cells are not fully understood. Here, we identified an E3 ubiquitin ligase (ARIH1/HHARI) that triggers mitophagy in cancer cells in a PINK1-dependent manner. We found that ARIH1/HHARI polyubiquitinates damaged mitochondria, leading to their removal via autophagy. Importantly, ARIH1 is widely expressed in cancer cells, notably in breast and lung adenocarcinomas; ARIH1 expression protects against chemotherapy-induced death. These data challenge the view that the main regulators of mitophagy are tumor suppressors, arguing instead that ARIH1-mediated mitophagy promotes therapeutic resistance.

Summary Mitochondrial dysfunction is interconnected with cancer. Nevertheless, how defective mitochondria promote cancer is poorly understood. We find that mitochondrial dysfunction promotes DNA damage under conditions of increased apoptotic priming. Underlying this process, we reveal a key role for mitochondrial dynamics in the regulation of DNA damage and genome instability. The ability of mitochondrial dynamics to regulate oncogenic DNA damage centres upon the control of minority MOMP, a process that enables non-lethal caspase activation leading to DNA damage. Mitochondrial fusion suppresses minority MOMP, and its associated DNA damage, by enabling homogenous mitochondrial expression of anti-apoptotic BCL-2 proteins. Finally, we find that mitochondrial dysfunction inhibits pro-apoptotic BAX retrotranslocation, causing BAX mitochondrial localization thereby promoting minority MOMP. Unexpectedly, these data reveal oncogenic effects of mitochondrial dysfunction that are mediated via mitochondrial dynamics and caspase-dependent DNA damage.

Abstract Upon cell death signals, the apoptotic protease-activating factor Apaf1 and cytochrome c interact to form the apoptosome complex. The apoptosome is crucial for mitochondrial apoptosis, as it activates caspases that dismantle the cell. However, the assembly mechanism and appearance of the apoptosome in vivo remain unclear. We show that upon onset of apoptosis, Apaf1 molecules accumulate into multiple foci per cell. Disassembly of the foci is linked to survival of the cell. Structurally, Apaf1 foci resemble organelle-sized, cloud-like assemblies. Foci form upon specific molecular interactions with cytochrome c and depending on procaspase-9. We propose that Apaf1 foci correspond to the apoptosome in cells. Transientness and ultrastructure of Apaf1 foci suggest that the dynamic spatiotemporal organisation of apoptosome components regulates progression of apoptosis.

Abstract Centrosomes are membrane-less organelles that orchestrate a wide array of biological functions by acting as microtubule organizing centers. Recently, the centrosome has been implicated in caspase-1 activation and inflammasome-driven pyroptosis. Here, we report that caspase-2-driven apoptosis is elicited in blood cells that fail cytokinesis and that extra centrosomes are necessary to trigger this cell death. Activation of caspase-2 depends on the PIDDosome multi-protein complex and priming of PIDD1 at extra centrosomes is critical for this signalling pathway. Accordingly, loss of its centrosomal adapter, ANKRD26, allows for cell survival and unrestricted polyploidization in response to cytokinesis failure. Mechanistically, cell death is initiated upstream of mitochondria and caspase-9 via caspase-2-mediated processing of the proapoptotic BCL2 family protein BID, driving BAX/BAK-dependent mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP). Remarkably, BID-deficient cells enforce apoptosis by engaging a p53-dependent pro-apoptotic transcriptional response initiated by caspase-2. Consistently, MDM2 and BID act as shared caspase-2 substrates that synergize to promote cell killing. Our findings document that the centrosome limits its own unscheduled duplication by the induction of PIDDosome-driven mitochondrial apoptosis to avoid potentially pathogenic polyploidization events.

Depending on its expression levels, FLIP(L) can act as an activator or inhibitor of caspase-8 at the TRAIL-R2 death-inducing signalling complex (DISC). Here, we demonstrate that the Skp1-Cullin-1-F-box (SCF) Cullin-Ring E3 Ubiquitin Ligase complex containing Skp2 (SCFSkp2) regulates FLIP(L) protein expression by regulating its ubiquitination, and, unusually, this is mediated by direct binding of FLIP(L) to Cullin-1 rather than via Skp2. The interaction of FLIP(L) with SCFSkp2 is significantly stronger with its DISC-processed p43-form, and this interaction disrupts the ability of p43-FLIP to interact with FADD, caspase-8 and another DISC component, TRAF2. Moreover, we find that SCFSkp2 associates with TRAIL-R2 independently of canonical DISC components. Inhibition of Cullin-1 expression (using siRNA) or activity (using a NEDDylation inhibitor, MLN4924) enhanced FLIP(L) and TRAF2 levels at the TRAIL-R2 DISC and enhanced caspase-8 activation and apoptosis induction. These findings provide new insights into how FLIP(L) expression and TRAIL receptor signaling is controlled.

Mitochondria are often essential for apoptosis through mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP). This central event enables cytochrome c release leading to caspase activation and rapid cell death. Recently, MOMP has been shown to be inherently pro-inflammatory, for instance, by enabling mitochondrial DNA-dependent activation of cGAS-STING signalling. Alongside having emerging functions in health and disease, MOMP associated inflammation can also elicit anti-tumour immunity. Nonetheless, how MOMP triggers inflammation and how the cell counteracts this remains poorly defined. We find that upon MOMP, mitochondria are ubiquitylated in a promiscuous manner targeting proteins localised to both inner and outer mitochondrial membranes. Mitochondrial ubiquitylation serves to recruit the essential adaptor molecule, NEMO, leading to activation of pro-inflammatory NF-kB signalling. We find that disruption of mitochondrial outer membrane integrity through different means leads to engagement of a similar pro-inflammatory signalling platform. Thus, mitochondrial integrity directly controls inflammation, such that permeabilised mitochondria initiate NF-kB signalling. This event may be important for the various pathophysiological functions of MOMP-associated inflammation.

During apoptosis, pro-apoptotic BAX and BAK are activated, causing mitochondrial outer membrane permeabilisation (MOMP), caspase activation and cell death. However, even in the absence of caspase activity, cells usually die following MOMP. Such caspase-independent cell death is accompanied by inflammation that requires mitochondrial DNA (mtDNA) activation of cGAS-STING signaling. Because the mitochondrial inner membrane is thought to remain intact during apoptosis, we sought to address how matrix mtDNA could activate the cytosolic cGAS-STING signaling pathway. Strikingly, using super-resolution imaging, we show that mtDNA is efficiently released from mitochondria following MOMP. In a temporal manner, we find that following MOMP, BAX/BAKmediated mitochondrial outer membrane pores gradually widen over time. This allows extrusion of the mitochondrial inner membrane into the cytosol whereupon it permeablises allowing mtDNA release. Our data demonstrate that mitochondrial inner membrane permeabilisation can occur during cell death in a BAX/BAK-dependent manner. Importantly, by enabling the cytosolic release of mtDNA, inner membrane permeabilisation underpins the immunogenic effects of caspase independent cell death.