By homologous recombination, we have generated mice that lack the neuronal nitric oxide synthase (NOS) gene. Neuronal NOS expression and NADPH-diaphorase (NDP) staining are absent in the mutant mice. Very low level residual catalytic activity suggests that other enzymes in the brain may generate nitric oxide. The neurons normally expressing NOS appear intact, and the mutant NOS mice are viable, fertile, and without evident histopathological abnormalities in the central nervous system. The most evident effect of disrupting the neuronal NOS gene is the development of grossly enlarged stomachs, with hypertrophy of the pyloric sphincter and the circular muscle layer. This phenotype resembles the human disorder infantile pyloric stenosis, in which gastric outlet obstruction is associated with the lack of NDP neurons in the pylorus.

We tested the hypothesis that endothelial nitric oxide synthase (eNOS) modulates angiogenesis in two animal models in which therapeutic angiogenesis has been characterized as a compensatory response to tissue ischemia. We first administered L-arginine, previously shown to augment endogenous production of NO, to normal rabbits with operatively induced hindlimb ischemia. Angiogenesis in the ischemic hindlimb was significantly improved by dietary supplementation with L-arginine, compared to placebo-treated controls; angiographically evident vascularity in the ischemic limb, hemodynamic indices of limb perfusion, capillary density, and vasomotor reactivity in the collateral vessel-dependent ischemic limb were all improved by oral L-arginine supplementation. A murine model of operatively induced hindlimb ischemia was used to investigate the impact of targeted disruption of the gene encoding for ENOS on angiogenesis. Angiogenesis in the ischemic hindlimb was significantly impaired in eNOS-/- mice versus wild-type controls evaluated by either laser Doppler flow analysis or capillary density measurement. Impaired angiogenesis in eNOS-/- mice was not improved by administration of vascular endothelial growth factor (VEGF), suggesting that eNOS acts downstream from VEGF. Thus, (a) eNOS is a downstream mediator for in vivo angiogenesis, and (b) promoting eNOS activity by L-arginine supplementation accelerates in vivo angiogenesis. These findings suggest that defective endothelial NO synthesis may limit angiogenesis in patients with endothelial dysfunction related to atherosclerosis, and that oral L-arginine supplementation constitutes a potential therapeutic strategy for accelerating angiogenesis in patients with advanced vascular obstruction.

Infarct size and vascular hemodynamics were measured 24 h after middle cerebral artery (MCA) occlusion in mice genetically deficient in the endothelial nitric oxide synthase (eNOS) isoform. eNOS mutant mice developed larger infarcts (21%) than the wild-type strain when assessed 24 h after intraluminal filament occlusion. Moreover, regional CBF values recorded in the MCA territory by laser-Doppler flowmetry were more severely reduced after occlusion and were disproportionately reduced during controlled hemorrhagic hypotension in autoregulation experiments. Unlike the situation in wild-type mice, nitro-L-arginine superfusion (1 m M) dilated pial arterioles of eNOS knockout mice in a closed cranial window preparation. As noted previously, eNOS mutant mice were hypertensive. However, infarct size remained increased despite lowering blood pressure to normotensive levels by hydralazine treatment. Systemic administration of nitro-L-arginine decreased infarct size in eNOS mutant mice (24%) but not in the wild-type strain. This finding complements published data showing that nitro-L-arginine increases infarct size in knockout mice expressing the eNOS but not the neuronal NOS isoform (i.e., neuronal NOS knockout mice). We conclude that NO production within endothelium may protect brain tissue, perhaps by hemodynamic mechanisms, whereas neuronal NO overproduction may lead to neurotoxicity.

Interleukin-1β converting enzyme (ICE) is a mammalian homolog of CED-3, a protein required for programmed cell death in the nematode Caenorhabditis elegans . The activity of ICE can be specifically inhibited by the product of crmA , a cytokine response modifier gene encoded by cowpox virus. Microinjection of the crmA gene into chicken dorsal root ganglion neurons was found to prevent cell death induced by deprivation of nerve growth factor. Thus, ICE is likely to participate in neuronal death in vertebrates.

Mutations of the gene (TNNT2) encoding the thin-filament contractile protein cardiac troponin T are responsible for 15% of all cases of familial hypertrophic cardiomyopathy, the leading cause of sudden death in young athletes. Mutant proteins are thought to act through a dominant-negative mode that impairs function of heart muscle. TNNT2 mutations can also lead to dilated cardiomyopathy, a leading cause of heart failure. Despite the importance of cardiac troponin T in human disease, its loss-of-function phenotype has not been described. We show that the zebrafish silent heart (sih) mutation affects the gene tnnt2. We characterize two mutated alleles of sih that severely reduce tnnt2 expression: one affects mRNA splicing, and the other affects gene transcription. Tnnt2, together with alpha-tropomyosin (Tpma) and cardiac troponins C and I (Tnni3), forms a calcium-sensitive regulatory complex within sarcomeres. Unexpectedly, in addition to loss of Tnnt2 expression in sih mutant hearts, we observed a significant reduction in Tpma and Tnni3, and consequently, severe sarcomere defects. This interdependence of thin-filament protein expression led us to postulate that some mutations in tnnt2 may trigger misregulation of thin-filament protein expression, resulting in sarcomere loss and myocyte disarray, the life-threatening hallmarks of TNNT2 mutations in mice and humans.

ABSTRACT As part of a large-scale mutagenesis screen of the zebrafish genome, we have identified 58 mutations that affect the formation and function of the cardiovascular system. The cardiovascular system is particularly amenable for screening in the transparent zebrafish embryo because the heart and blood vessels are prominent and their function easily examined. We have classified the mutations affecting the heart into those that affect primarily either morphogenesis or function. Nine mutations clearly disrupt the formation of the heart. cloche deletes the endocardium. In cloche mutants, the myocardial layer forms in the absence of the endocardium but is dysmorphic and exhibits a weak contractility. Two loci, miles apart and bonnie and clyde, play a critical role in the fusion of the bilateral tubular primordia. Three mutations lead to an abnormally large heart and one to the formation of a diminutive, dysmorphic heart. We have found no mutation that deletes the myocardial cells altogether, but one, pandora, appears to eliminate the ventricle selectively. Seven mutations interfere with vascular integrity, as indicated by hemorrhage at particular sites. In terms of cardiac function, one large group exhibits a weak beat. In this group, five loci affect both chambers and seven a specific chamber (the atrium or ventricle). For example, the weak atrium mutation exhibits an atrium that becomes silent but has a normally beating ventricle. Seven mutations affect the rhythm of the heart causing, for example, a slow rate, a fibrillating pattern or an apparent block to conduction. In several other mutants, regurgitation of blood flow from ventricle to atrium is the most prominent abnormality, due either to the absence of valves or to poor coordination between the chambers with regard to the timing of contraction. The mutations identified in this screen point to discrete and critical steps in the formation and function of the heart and vasculature.