Following light-induced nuclear translocation, specific members of the phytochrome (phy) photoreceptor family (phyA to phyE) interact with bHLH transcription factors, such as PIF3, and induce changes in target-gene expression. The biochemical mechanism comprising signal transfer from phy to PIF3 has remained undefined but results in rapid degradation of PIF3. We provide evidence that photoactivation of phy induces rapid in vivo phosphorylation of PIF3 preceding degradation. Both phyA and phyB redundantly induce this PIF3 phosphorylation, as well as nuclear speckle formation and degradation, by direct interaction with PIF3 via separate binding sites. These data suggest that phy-induced phosphorylation of proteins such as PIF3 may represent the primary intermolecular signaling transaction of the activated photoreceptor, tagging the target protein for proteosomal degradation, possibly in nuclear speckles.

Photosynthetic organisms must achieve a delicate balance between the light energy absorbed by chlorophyll and their capacity to channel that energy into productive photochemical reactions. Release of excess absorbed energy in the cell can cause lethal photooxidative damage. We identified a basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factor, designated PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR 1 (PIF1), that negatively regulates chlorophyll biosynthesis. pif1 mutant seedlings accumulate excess free protochlorophyllide when grown in the dark, with consequent lethal bleaching upon exposure to light. PIF1 interacts specifically with the photoactivated conformer of phytochromes A and B, suggesting a signaling pathway by which chlorophyll biosynthetic rates are tightly controlled during the critical initial emergence of seedlings from subterranean darkness into sunlight.

Abstract We show that a previously uncharacterized Arabidopsis thaliana basic helix-loop-helix (bHLH) phytochrome interacting factor (PIF), designated PIF7, interacts specifically with the far-red light–absorbing Pfr form of phyB through a conserved domain called the active phyB binding motif. Similar to PIF3, upon light exposure, PIF7 rapidly migrates to intranuclear speckles, where it colocalizes with phyB. However, in striking contrast to PIF3, this process is not accompanied by detectable light-induced phosphorylation or degradation of PIF7, suggesting that the consequences of interaction with photoactivated phyB may differ among PIFs. Nevertheless, PIF7 acts similarly to PIF3 in prolonged red light as a weak negative regulator of phyB-mediated seedling deetiolation. Examination of pif3, pif4, and pif7 double mutant combinations shows that their moderate hypersensitivity to extended red light is additive. We provide evidence that the mechanism by which these PIFs operate on the phyB signaling pathway under prolonged red light is through maintaining low phyB protein levels, in an additive or synergistic manner, via a process likely involving the proteasome pathway. These data suggest that the role of these phyB-interacting bHLH factors in modulating seedling deetiolation in prolonged red light may not be as phy-activated signaling intermediates, as proposed previously, but as direct modulators of the abundance of the photoreceptor.

ABSTRACT Heterochromatin spreading, the expansion of gene-silencing structures from DNA-encoded nucleation sites, occurs in distinct settings. Spreading re-establishes gene-poor constitutive heterochromatin every cell cycle, but also invades gene-rich euchromatin de novo to steer cell fate decisions. How chromatin context, i.e. euchromatic, heterochromatic, or different nucleator types, influences the determinants of this process remains poorly understood. By screening a nuclear function gene deletion library in fission yeast using a previously established heterochromatin spreading sensor system, we identified regulators that positively or negatively alter the propensity of a nucleation site to spread heterochromatin. We find that different chromatin contexts are dependent on unique sets of genes for the regulation of heterochromatin spreading. Further, we find that spreading in constitutive heterochromatin requires Clr6 histone deacetylase complexes containing the Fkh2 transcription factor, while the Clr3 deacetylase is globally required for silencing. Fkh2 acts by recruiting Clr6 to nucleation-distal chromatin sites. Our results segregate the pathways that control lateral heterochromatin spreading from those that instruct DNA-directed assembly in nucleation.

Abstract Heterochromatin formation requires three distinct steps: nucleation, self-propagation (spreading) along the chromosome, and faithful maintenance after each replication cycle. Impeding any of those steps induces heterochromatin defects and improper gene expression. The essential histone chaperone FACT has been implicated in heterochromatin silencing, however, the mechanisms by which FACT engages in this process remain opaque. Here, we pin-pointed its function to the heterochromatin spreading process. FACT impairment reduces nucleation-distal H3K9me3 and HP1/Swi6 accumulation at subtelomeres and derepresses genes in the vicinity of heterochromatin boundaries. FACT promotes spreading by repressing heterochromatic histone turnover, which is crucial for the H3K9me2 to me3 transition that enables spreading. FACT mutant spreading defects are suppressed by removal of the H3K9 methylation antagonist Epe1 via nucleosome stabilization. Together, our study identifies FACT as a histone chaperone that specifically promotes heterochromatin spreading and lends support to the model that regulated histone turnover controls the propagation of epigenetic marks.

Abstract Heterochromatic gene silencing relies on combinatorial control by specific histone modifications, the occurrence of transcription, and/or RNA degradation. Once nucleated, heterochromatin propagates within defined chromosomal regions and is maintained throughout cell divisions to warrant proper genome expression and integrity. The fission yeast Ccr4-Not complex has been involved in gene silencing, but its relative contribution to distinct heterochromatin domains and its role in nucleation versus spreading have remained elusive. Here, we unveil major functions for Ccr4-Not in silencing and heterochromatin spreading at the mating type locus and subtelomeres. Mutations of the catalytic subunits Caf1 or Mot2, involved in RNA deadenylation and protein ubiquitinylation respectively, result in impaired propagation of H3K9me3 and massive accumulation of nucleation-distal heterochromatic transcripts. Both silencing and spreading defects are suppressed upon disruption of the heterochromatin antagonizing factor Epe1. Overall, our results position the Ccr4-Not complex as a critical, dual regulator of heterochromatic gene silencing and spreading. Author Summary Eukaryotic genomes are partitioned into relaxed, gene-rich regions, and condensed, gene-poor domains called heterochromatin. The maintenance of heterochromatin is crucial for proper genome expression and integrity, and requires multiple factors regulating histone modifications and/or the levels of RNA molecules produced from these regions. Such effectors not only promote heterochromatin assembly but also ensure its propagation from specific nucleation sites to defined domain boundaries. However, while the mechanisms involved in initiation of heterochromatin formation have been well documented, the molecular and biochemical properties underlying its spreading remain largely elusive. By combining genetic and single-cell approaches, we report here that the fission yeast Ccr4-Not complex, a multisubunit complex conserved throughout eukaryotes, is essential for efficient heterochromatin spreading to repress expression of nucleation-distal RNAs. The two catalytic activities of the complex, RNA deadenylation and protein ubiquitinylation, are each critical, thereby defining a dual enzymatic requirement in the process.

The heterochromatin spreading reaction is a central contributor to the formation of gene-repressive structures, which are re-established with high fidelity following replication. The high fidelity of this process is not obviously encoded in the primary spreading reaction. To resolve origins of stable inheritance of repression, we probed the intrinsic fidelity of spreading events in fission yeast using a system that quantitatively describes the spreading reaction in live single cells. We show that spreading from RNAi-nucleated elements is stochastic, multimodal, and fluctuates dynamically across time. In contrast, a second form of spreading, nucleated by the cis-acting element REIII, is deterministic, has high memory capacity and acts as the source of locus fidelity. REIII enables fidelity in part by endowing the locus with resistance to perturbations. Together, our results suggest that epigenetic capacity may not be intrinsically encoded in the spreading reaction, but rather requires collaboration with specialized memory elements.

ABSTRACT Unique among metazoan repressive histone methyltransferases, G9a and GLP, which chiefly target histone 3 lysine 9 (H3K9), require dimerization for productive H3K9 mono (me1)- and dimethylation (me2) in vivo . Intriguingly, even though each enzyme can independently methylate H3K9, the predominant active form in vivo is a heterodimer of G9a and GLP. How dimerization influences the central H3K9 methyl binding (“reading”) and deposition (“writing”) activity of G9a and GLP, and why heterodimerization is essential in vivo remains opaque. Here, we examine the H3K9me “reading” and “writing” activities of defined, recombinantly produced homo- and heterodimers of G9a and GLP. We find that both reading and writing are significantly enhanced in the heterodimer. Compared to the homodimers, the heterodimer has higher recognition of H3K9me2, and a striking ∼ 10-fold increased turnover rate for nucleosomal substrates under multiple turnover conditions, which is not evident on histone tail peptide substrates. Crosslinking Mass Spectrometry suggests that differences between the homodimers and the unique activity of the heterodimer may be encoded in altered ground state conformations, as each dimer displays different domain contacts. Our results indicate that heterodimerization may be required to relieve autoinhibition of H3K9me reading and chromatin methylation evident in G9a and GLP homodimers. Relieving this inhibition may be particularly important in early differentiation when large tracts of H3K9me2 are deposited by G9a-GLP, which may require a more active form of the enzyme.

Heterochromatin plays a critical role in regulating gene expression and maintaining genome integrity. While structural and enzymatic components have been linked to heterochromatin establishment, a comprehensive view of the underlying pathways at diverse heterochromatin domains remains elusive. Here, we developed a systematic approach to identify factors involved in heterochromatin silencing at pericentromeres, subtelomeres, and the silent mating type locus in Schizosaccharomyces pombe . Using quantitative measures, iterative genetic screening, and domain-specific heterochromatin reporters, we identified 369 mutants with different degrees of reduced or enhanced silencing. As expected, mutations in the core heterochromatin machinery globally decreased silencing. However, most other mutants exhibited distinct qualitative and quantitative profiles that indicate domain-specific functions. For example, decreased mating type silencing was linked to mutations in heterochromatin maintenance genes, while compromised subtelomere silencing was associated with metabolic pathways. Furthermore, similar phenotypic profiles revealed shared functions for subunits within complexes. We also discovered that the uncharacterized protein Dhm2 plays a crucial role in maintaining constitutive and facultative heterochromatin, while its absence caused phenotypes akin to DNA replication-deficient mutants. Collectively, our systematic approach unveiled a landscape of domain-specific heterochromatin regulators controlling distinct states and identified Dhm2 as a previously unknown factor linked to heterochromatin inheritance and replication fidelity.

Protection of euchromatin from invasion by gene-repressive heterochromatin is critical for cellular health and viability. In addition to constitutive loci such as pericentromeres and subtelomeres, heterochromatin can be found interspersed in gene-rich euchromatin, where it regulates gene expression pertinent to cell fate. While hetero- and euchromatin are globally poised for mutual antagonism, the mechanisms underlying precise spatial encoding of heterochromatin containment within euchromatic sites remain opaque. We investigated ectopic heterochromatin invasion by manipulating the fission yeast mating type locus boundary, using a single-cell spreading reporter system. We found that heterochromatin repulsion is locally encoded by Set1/COMPASS on certain actively transcribed genes and that this protective role is most prominent at heterochromatin islands, small domains interspersed in euchromatin that regulate cell fate specifiers. Interestingly, this effect can be gene orientation dependent. Sensitivity to invasion by heterochromatin, surprisingly, is not dependent on Set1 altering overall gene expression levels. At least two independent pathways direct this Set1 activity: Inhibition of catalysis by Suv39/Clr4 and disruption of nucleosome stability. Taken together, these results describe a mechanism for spatial encoding of euchromatic signals that repel heterochromatin invasion.