Abstract The role of the RNA degradation product 2’,3’-cyclic adenosine monophosphate (2’,3’-cAMP) is poorly understood. Recent studies have identified 2’,3’-cAMP in plant material and determined its role in stress signaling. The level of 2’,3’-cAMP increases upon wounding, dark, and heat, and 2’,3’-cAMP by binding to an RNA-binding protein, Rbp47b, promotes stress granule (SG) assembly. To gain further mechanistic insight into 2’,3’-cAMP function, we used a multi-omics approach combining transcriptomics, metabolomics, and proteomics to dissect Arabidopsis response to 2’,3’-cAMP treatment. We demonstrated that 2’,3’-cAMP is metabolized into adenosine, suggesting that the well-known cyclic nucleotide–adenosine pathway from human cells might also exist in plants. Transcriptomic analysis revealed only minor overlap between 2’,3’-cAMP-and adenosine-treated plants, suggesting that these molecules act through independent mechanisms. Treatment with 2’,3’-cAMP changed the levels of hundreds of transcripts, proteins, and metabolites, many previously associated with plant stress responses including protein and RNA degradation products, glucosinolates, chaperones and SG components. Finally, we demonstrated that 2’,3’-cAMP treatment influences the movement of processing bodies, supporting the role of 2’,3’-cAMP in the formation and motility of membraneless organelles.

Abstract Raffinose (Raf) protects plant cells during seed desiccation and under different abiotic stress conditions. The biosynthesis of Raf starts with the production of UDP-galactose by UDP-sugar pyrophosphorylase (USPPase) and continues with the synthesis of galactinol by galactinol synthase (GolSase). Galactinol is then used by Raf synthase to produce Raf. In this work, we report the biochemical characterization of USPPase ( Bdi USPPase) and GolSase 1 ( Bdi GolSase1) from Brachypodium distachyon . The catalytic efficiency of Bdi USPPase was similar with galactose 1-phosphate and glucose 1-phosphate, but 5-to 17-fold lower with other sugar 1-phosphates. The catalytic efficiency of Bdi GolSase1 with UDP-galactose was three orders of magnitude higher than with UDP-glucose. A structural model of Bdi GolSase1 allowed us to determine the residues putatively involved in the binding of substrates. Among these, we found that Cys 261 lies within the putative catalytic pocket. Bdi GolSase1 was inactivated by oxidation with diamide and H 2 O 2 . The activity of the diamide-oxidized enzyme was recovered by reduction with dithiothreitol or E. coli thioredoxin, suggesting that Bdi GolSase1 is redox-regulated.

Abstract In our pursuit of understanding the protein-metabolite interactome, we introduced PROMIS, a co-fractionation mass spectrometry (CF-MS) technique focusing on biosynthetic and regulatory processes. However, the challenge lies in distinguishing true interactors from coincidental co-elution when a metabolite co-fractionates with numerous proteins. To address this, we integrated two chromatographic techniques— size exclusion and ion exchange—to enhance the mapping of protein-metabolite interactions (PMIs) in Escherichia coli . This integration aims to refine the PMI network by considering size and charge characteristics, resulting in 994 interactions involving 51 metabolites and 465 proteins. The PMI network is enriched for known and predicted interactions validating our approach’s efficacy. Furthermore, the analysis of protein targets for different metabolites revealed novel functional insights, such as the connection between proteinogenic dipeptides and fatty acid biosynthesis. Notably, we uncovered an inhibitory interaction between the riboflavin degradation product lumichrome and orotate phosphoribosyltransferase (PyrE), a key enzyme in de novo pyrimidine synthesis. Lumichrome supplementation mimicked the biofilm formation inhibition observed in a ΔpyrE mutant strain, suggesting lumichrome role in integrating pyrimidine and riboflavin metabolism with quorum sensing and biofilm formation. In summary, our integrated chromatographic approach significantly advances PMI mapping, offering novel insights into functional associations and potential regulatory mechanisms in E. coli .