Abstract Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as cardiac pacemaker cells by firing spontaneous action potentials (APs) that initiate each heartbeat. The funny current, I f , is critical for the generation of these spontaneous APs; however, its precise role during the pacemaking cycle remains unresolved. We used the AP-clamp technique to quantify I f during the cardiac cycle in mouse SAMs. We found that I f is persistently active throughout the sinoatrial AP, with surprisingly little voltage-dependent gating. As a consequence, it carries both inward and outward current around its reversal potential of -30 mV. Despite operating at only 2-5% of its maximal conductance, I f carries a substantial fraction of both depolarizing and repolarizing net charge movement during the firing cycle. We also show that β-adrenergic receptor stimulation increases the percentage of net depolarizing charge moved by I f , consistent with a contribution of I f to the fight-or-flight increase in heart rate. These properties were confirmed by heterologously-expressed HCN4 channels and by mathematical models of I f . Modelling further suggested that the slow activation and deactivation of the HCN4 isoform underlie the persistent activity of I f during the sinoatrial AP. These results establish a new conceptual framework for the role of I f in pacemaking, in which it operates at a very small fraction of maximal activation but nevertheless drives membrane potential oscillations in SAMs by providing substantial driving force in both inward and outward directions. Significance Statement Cardiac pacemaker cells trigger each heartbeat by virtue of spontaneous oscillations in their membrane voltage. Although the funny current (If) is critical for these oscillations and for setting heart rate, its precise role remains an enigma because it activates mostly outside of the physiological voltage range and quite slowly relative to the pacemaker cycle. Here we show that I f is persistently active in pacemaker cells; once opened, the small fraction of ion channels that conduct I f do not re-close. Consequently, I f flows both inward and outward to help propel the voltage oscillations and it paradoxically conducts a large fraction of the net charge movement. These results establish a new conceptual framework for the role of I f in driving cardiac pacemaking.

Lymphoid restricted membrane protein (LRMP) is a specific regulator of the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-sensitive isoform 4 (HCN4) channel. LRMP prevents cAMP-dependent potentiation in HCN4 but the interaction domains, mechanisms of action, and basis for isoform-specificity remain unknown. Here we identify the domains of LRMP essential for regulation, we show that LRMP acts by disrupting the intramolecular signal transduction between cyclic nucleotide binding and gating, and we demonstrate that non-conserved regions in HCN4 are required for LRMP isoform-specificity. Using patch clamp electrophysiology and Förster resonance energy transfer (FRET), we show that the initial 227 residues of LRMP and the N-terminus of HCN4 are necessary for LRMP to interact with HCN4. We also found that the HCN4 N-terminus and HCN4-specific residues in the C-linker are necessary for regulation of HCN4 by LRMP. Taken together, these results suggest that LRMP modulates HCN4 through an isoform-specific interaction involving the N-terminals of both proteins, and that this interaction inhibits the transduction between cAMP binding and channel activation via an interface involving the N-terminus, C-linker, and S4-S5 linker of HCN4.

ABSTRACT The highly repetitive and transcriptionally active ribosomal DNA (rDNA) genes are exceedingly susceptible to genotoxic stress. Induction of DNA double-strand breaks (DSBs) in rDNA repeats is associated with ATM-dependent rDNA silencing and nucleolar reorganization where rDNA is segregated into nucleolar caps. However, the regulatory events underlying this response remain elusive. Here, we identify protein UFMylation as essential for rDNA damage response in human cells. We further show the only UFM1-E3-ligase UFL1 and its binding partner DDRGK1 localize to nucleolar caps upon rDNA damage, and that UFL1 loss impairs ATM activation and rDNA transcriptional silencing, leading to reduced rDNA segregation. A first-ever analysis of nuclear and nucleolar UFMylation targets in response to DSBs induction further identified key DNA repair factors including ATM, in addition to chromatin and actin network regulators. Taken together, our data provides the first evidence of an essential role for UFMylation in orchestrating rDNA DSB repair.

Abstract The sympathetic nervous system fight-or-flight response is characterized by a rapid increase in heart rate, which is mediated by an increase in the spontaneous action potential (AP) firing rate of pacemaker cells in the sinoatrial node. Sympathetic neurons stimulate sinoatrial myocytes (SAMs) by activating β adrenergic receptors (βARs) and increasing cAMP. The funny current (I f ) is among the cAMP-sensitive currents in SAMs. I f is critical for pacemaker activity, however, its role in the fight-or-flight response remains controversial. In this study, we used AP waveform analysis, machine learning, and dynamic clamp experiments in acutely-isolated SAMs from mice to quantitatively define the AP waveform changes and role of I f in the fight-or-flight response. We found that while βAR stimulation significantly altered nearly all AP waveform parameters, the increase in AP firing rate was only correlated with changes in a subset of parameters (diastolic duration, late AP duration, and diastolic depolarization rate). Dynamic clamp injection of the βAR-sensitive component of I f showed that it accounts for approximately 41% of the fight-or-flight increase in AP firing rate and 60% of the decrease in the interval between APs. Thus, I f is an essential contributor to the fight-or-flight increase in heart rate.

Skeletal muscle channelopathies, many of which are inherited as autosomal dominant mutations, include both myotonia and periodic paralysis. Myotonia is defined by a delayed relaxation after muscular contraction, whereas periodic paralysis is defined by episodic attacks of weakness. One sub-type of periodic paralysis, known as hypokalemic periodic paralysis (hypoPP), is associated with low potassium levels. Interestingly, the P1158S missense mutant, located in the third domain S4-S5 linker of the "skeletal muscle" voltage-gated sodium channel, Nav1.4, has been implicated in causing both myotonia and hypoPP. A common trigger for these conditions is physical activity. We previously reported that Nav1.4 is relatively insensitive to changes in extracellular pH compared to Nav1.2 and Nav1.5. Given that intense exercise is often accompanied by blood acidosis, we decided to test whether changes in pH would push gating in P1158S towards either phenotype. Our results indicate that, unlike in WT Nav1.4, low pH depolarizes the voltage-dependence of activation and steady-state fast inactivation, decreases current density, and increases late currents in P1185S. Thus, P1185S turns the normally pH-insensitive Nav1.4 into a proton-sensitive channel. Using action potential modeling we also predict a pH-to-phenotype correlation in patients with P1158S. We conclude that activities which alter blood pH may trigger myotonia or periodic paralysis in P1158S patients.

The sinoatrial node (SN) generates the heart rate (HR). Its spontaneous activity is regulated by a complex interplay between the modulation by the autonomic nervous system (ANS) and intrinsic factors including ion channels in SN cells. However, the systemic and intrinsic regulatory mechanisms are still poorly understood. This study aimed to elucidate the sex-specific differences in heart morphology and SN function, particularly focusing on basal HR, expression and function of hyperpolarization-activated HCN4 and HCN1 channels and mRNA abundance of ion channels and mRNA abundance of ion channels contributing to diastolic depolarization (DD) and spontaneous action potentials (APs).

Ion channels in excitable cells function in macromolecular complexes in which auxiliary proteins modulate the biophysical properties of the pore-forming subunits. Hyperpolarization-activated, cyclic nucleotide-sensitive HCN4 channels are critical determinants of membrane excitability in cells throughout the body, including thalamocortical neurons and cardiac pacemaker cells. We previously showed that the properties of HCN4 channels differ dramatically in different cell types, possibly due to the endogenous expression of auxiliary proteins. Here, we report the discovery of a family of endoplasmic reticulum transmembrane proteins that interact with and modulate HCN4. Lymphoid-restricted membrane protein (LRMP, Jaw1) and inositol trisphosphate receptor-associated guanylate kinase substrate (IRAG, Mrvi1, Jaw1L) are homologous proteins with small ER luminal domains and large cytoplasmic domains. Despite their homology, LRMP and IRAG have distinct effects on HCN4. LRMP is a loss-of-function modulator that inhibits the canonical depolarizing shift in the voltage-dependence of HCN4 activation in response to binding of cAMP. In contrast, IRAG causes a gain of HCN4 function by depolarizing the basal voltage-dependence of activation in the absence of cAMP. The mechanisms of action of LRMP and IRAG are novel; they are independent of trafficking and cAMP binding, and they are specific to the HCN4 isoform. We also found that IRAG is highly expressed in the mouse sinoatrial node where computer modeling predicts that its presence increases HCN4 availability. Our results suggest important roles for LRMP and IRAG in regulation of cellular excitability and as tools for advancing mechanistic understanding of HCN4 channel function.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.