ABSTRACT Host-viral interactions during SARS-CoV-2 infection are needed to understand COVID-19 pathogenesis and may help to guide the design of novel antiviral therapeutics. N 6 -methyladenosine modification (m 6 A), one of the most abundant cellular RNA modifications, regulates key processes in RNA metabolism during a stress response. Gene expression profiles observed post-infection with different SARS-CoV-2 variants show changes in the expression of genes related to RNA catabolism, including m 6 A readers and erasers. We found that infection with SARS-CoV-2 variants caused a loss of m 6 A in cellular RNAs, whereas m 6 A was detected abundantly in viral RNA. METTL3, the m 6 A methyltransferase, showed an unusual cytoplasmic localization post-infection. The B.1.351 variant had a less pronounced effect on METTL3 localization and loss of m 6 A than the B.1 and B.1.1.7 variants. We also observed a loss of m 6 A upon SARS-CoV-2 infection in air/liquid interface cultures of human airway epithelia, confirming that m 6 A loss is characteristic of SARS-CoV-2 infected cells. Further, transcripts with m 6 A modification were preferentially down-regulated post-infection. Inhibition of the export protein XPO1 resulted in the restoration of METTL3 localization, recovery of m 6 A on cellular RNA, and increased mRNA expression. Stress granule formation, which was compromised by SARS-CoV-2 infection, was restored by XPO1 inhibition and accompanied by a reduced viral infection in vitro . Together, our study elucidates how SARS-CoV-2 inhibits the stress response and perturbs cellular gene expression in an m 6 A-dependent manner.

ABSTRACT Predicting the immunogenicity of candidate vaccines in humans remains a challenge. To address this issue, we developed a Lymphoid Organ-Chip (LO chip) model based on a microfluidic chip seeded with human PBMC at high density within a 3D collagen matrix. Perfusion of the SARS-CoV-2 Spike protein mimicked a vaccine boost by inducing a massive amplification of Spike-specific memory B cells, plasmablast differentiation, and Spike-specific antibody secretion. Features of lymphoid tissue, including the formation of activated CD4+ T cell/B cell clusters and the emigration of matured plasmablasts, were recapitulated in the LO chip. Importantly, myeloid cells were competent at capturing and expressing mRNA vectored by lipid nanoparticles, enabling the assessment of responses to mRNA vaccines. Comparison of on-chip responses to Wuhan monovalent and Wuhan/Omicron bivalent mRNA vaccine boosts showed equivalent induction of Omicron neutralizing antibodies, pointing at immune imprinting as reported in vivo . The LO chip thus represents a versatile platform suited to the preclinical evaluation of vaccine boosting strategies.

Summary Patterning of endoderm into lung and thyroid lineages depends upon a correct early expression of a homeobox domain-containing transcription factor, Nkx2-1. However, the gene networks distinguishing the differentiation of those lineages remain largely unknown. In the present work, by using mouse embryonic stem cell lines, single-cell RNA sequencing, and transcriptomic and chromatin accessibility profiling, we show that knockout of Foxe1 drastically impairs Nkx2-1+ cells differentiation and maturation into thyroid follicular-like cells. Concomitantly, a subset of Foxe1 null/Nkx2-1+ cells have a remarkable ability in vitro to undergo a lung epithelial differentiation program and form lung-like organoids harboring cells transcriptionally similar with mouse fetal airway and alveolar cell types. These results demonstrate, for the first time, lung lineage derivation at the expense of thyroid lineage, by a simple removal of a transcription factor, and provide insights into the intricated mechanisms of fate decisions of endodermal cell types. Highlights - Forward programming of mESCs with transient Nkx2-1 and Pax8 overexpression, followed by c-AMP treatment, leads to differentiation of functional thyroid follicles in vitro ; - In absence of Foxe1, thyroid follicle-like structures, derived from mESCs, are scarce and non-functional; - Concomitantly, a subset of Nkx2-1-expressing cells generated from Foxe1KO mESCs spontaneously form lung organoids containing multiple differentiated lung cell types; - ATACseq analyses show higher chromatin remodeling in Nkx2-1-expressing cells in control compared to Foxe1KO cells, especially for genes involved in thyroid maturation and maintenance of the 3D structure of the follicle.

The thyroid gland captures iodide in order to synthesize hormones that act on almost all tissues and are essential for normal growth and metabolism. Low plasma levels of thyroid hormones lead to hypothyroidism, which is one of the most common disorder in humans and is not always satisfactorily treated by lifelong hormone replacement. Therefore, in addition to the lack of in vitro tractable models to study human thyroid development, differentiation and maturation, functional human thyroid organoids could pave the way to explore new therapeutic approaches. Here we report the first transplantable thyroid organoids derived from human embryonic stem cells capable of restoring plasma thyroid hormone to athyreotic mice as a proof of concept for future therapeutic development.

Thyroid cancer is the most common endocrine malignancy and several genetic events have been described to promote the development of thyroid carcinogenesis. Besides the effects of specific mutations on thyroid cancer development, the molecular mechanisms controlling tumorigenesis, tumor behavior, and drug resistance are still largely unknown. Cancer organoids have been proposed as a powerful tool to study aspects related to tumor development and progression and appear promising to test individual responses to therapies. Here, using mESC-derived thyroid organoids, we developed a Braf V637E - inducible model able to recapitulate the features of papillary thyroid cancer in vitro . Overexpression of the murine Braf V637E mutation, equivalent to Braf V600E in humans, rapidly triggers to MAPK activation, cell dedifferentiation, and disruption of follicular organization. Braf V637E -expressing organoids show a transcriptomic signature for p53, focal adhesion, ECM-receptor interactions, EMT, and inflammatory signaling pathways. Finally, PTC-like thyroid organoids were used for drug screening assays. The combination of MAPK and PI3K inhibitors reversed Braf V637E oncogene-promoted cell dedifferentiation while restoring thyroid follicle organization and function in vitro . Our results demonstrate that pluripotent stem cells-derived thyroid cancer organoids can mimic tumor development and features while providing an efficient tool for testing novel targeted therapies.

Abstract The thyroid gland regulates metabolism and growth via secretion of thyroid hormones by thyroid follicular cells (TFCs). Loss of TFCs, by cellular dysfunction, autoimmune destruction or surgical resection, underlies hypothyroidism. Recovery of thyroid hormone levels by transplantation of mature TFCs derived from stem cells in vitro holds great therapeutic promise. However, the utilization of in vitro derived tissue for regenerative medicine is restricted by the efficiency of differentiation protocols to generate mature organoids. Here, to improve the differentiation efficiency for thyroid organoids, we utilized single-cell RNA-Seq to chart the molecular steps undertaken by individual cells during the in vitro transformation of mouse embryonic stem cells to TFCs. Our single-cell atlas of mouse organoid systematically and comprehensively identifies, for the first time, the cell types generated during production of thyroid organoids. Using pseudotime analysis, we identify TGF-beta and planar-cell polarity (PCP) pathways as regulators of thyroid maturation in vitro . Using pharmacological manipulation of TGF-beta pathway, we improve the level of thyroid maturation, in particular the induction of Nis expression. This in turn, leads to an enhancement of iodide organification in vitro , suggesting functional improvement of the thyroid organoid. Our study highlights the potential of single-cell molecular characterization in understanding and improving thyroid maturation and paves the way for identification of therapeutic targets against thyroid disorders.

Predicting the immunogenicity of candidate vaccines in humans remains a challenge. To address this issue, we developed a lymphoid organ-chip (LO chip) model based on a microfluidic chip seeded with human PBMC at high density within a 3D collagen matrix. Perfusion of the SARS-CoV-2 spike protein mimicked a vaccine boost by inducing a massive amplification of spike-specific memory B cells, plasmablast differentiation, and spike-specific antibody secretion. Features of lymphoid tissue, including the formation of activated CD4+ T cell/B cell clusters and the emigration of matured plasmablasts, were recapitulated in the LO chip. Importantly, myeloid cells were competent at capturing and expressing mRNA vectored by lipid nanoparticles, enabling the assessment of responses to mRNA vaccines. Comparison of on-chip responses to Wuhan monovalent and Wuhan/Omicron bivalent mRNA vaccine boosts showed equivalent induction of Omicron neutralizing antibodies, pointing at immune imprinting as reported in vivo. The LO chip thus represents a versatile platform suited to the preclinical evaluation of vaccine-boosting strategies.