Amputation of the axolotl forelimb results in the formation of a blastema, a transient tissue where progenitor cells accumulate prior to limb regeneration. However, the molecular understanding of blastema formation had previously been hampered by the inability to identify and isolate blastema precursor cells in the adult tissue. We have used a combination of Cre-loxP reporter lineage tracking and single-cell messenger RNA sequencing (scRNA-seq) to molecularly track mature connective tissue (CT) cell heterogeneity and its transition to a limb blastema state. We have uncovered a multiphasic molecular program where CT cell types found in the uninjured adult limb revert to a relatively homogenous progenitor state that recapitulates an embryonic limb bud-like phenotype including multipotency within the CT lineage. Together, our data illuminate molecular and cellular reprogramming during complex organ regeneration in a vertebrate.

Abstract The salamander limb regenerates only the missing portion. Each limb segment can only form segments equivalent to- or more distal to their own identity, relying on a property termed “positional information”. How positional information is encoded in limb cells has been unknown. By cell-type-specific chromatin profiling of upper arm, lower arm, and hand, we found segment-specific levels of histone H3K27me3 at limb homeoprotein gene loci but not their upstream regulators, constituting an intrinsic segment information code. During regeneration, regeneration-specific regulatory elements became active prior to the re-appearance of developmental regulatory elements. This means that, in the hand segment, the permissive chromatin state of the hand homeoprotein gene HoxA13 engages with regeneration regulatory elements, bypassing the upper limb program.

Abstract Turbidity and opaqueness are inherent properties of tissues which limit the capacity to acquire microscopic images through large tissues. Creating a uniform refractive index, known as tissue clearing, overcomes most of these issues. These methods have enabled researchers to image large and complex 3D structures with unprecedented depth and resolution. However, tissue clearing has been adopted to a limited extent due to a combination of cost, time, complexity of existing methods and potential negative impact on fluorescence signal. Here we describe 2Eci (2 nd generation Ethyl cinnamate based clearing method) which can be used to clear a wide range of tissues, including cerebral organoids, Drosophila melanogaster, zebrafish, axolotl, and Xenopus laevis in as little as 1-5 days while preserving a broad range of fluorescence proteins including GFP, mCherry, Brainbow, and alexa-fluorophores. Ethyl cinnamate is non-toxic and can easily be used in multi-user microscope facilities. This method will open up clearing to a much broader group of researchers, due to its broad applicability, ease of use, and non-toxic nature of Ethyl cinnamate. Summary statement The non-toxic, broadly applicable, and simplified protocol of 2Eci tissue clearing makes it possible for non-specialist labs to use clearing approaches on conventional inverted microscopes.

Abstract Primary body axis development is a highly conserved process that proceeds through somitogenesis and further subdivision into dermatome, myotome, and sclerotome. Defects in somitic-clock genes such as Hes7 lead to vertebral segmentation defects in mice and fish. Here we show that in the axolotl, Hes7 is also necessary for proper embryonic vertebral segmentation but is, surprisingly, dispensable during axolotl tail regeneration. Using genetic barcoding and fate mapping we found that during regeneration, the somitic derivatives (muscle, cartilage, tendon, fibroblasts) arose from tendon-like, Lfng + multi-potent stem cells residing at the myotendonal junction that we term “asomitic stem cells”. Throughout homeostasis and regeneration these stem cells display a distinct gene regulatory state compared to developmental progenitors with comparable lineage potential. These observations contrast to axolotl limb regeneration that proceeds via fibroblast dedifferentiation and the subsequent recapitulation of a limb developmental program. Taken together our research shows that divergent strategies are deployed between limb and tail regeneration, and that regeneration of complex body parts does not necessarily involve the complete redeployment of developmental programs.