Background: Autoinflammatory diseases (AID) result from dysregulation of the first lines of innate immune responses. Recently, development of high throughput genome sequencing technology led to the rapid emergence of important knowledge in the genetic field. About 20 genes have been identified so far in monogenic forms of distinct AID. However, 70-90 % of patients with AID remain without genetic diagnosis. Objective: We report the identification and characterization of a mutation in the C-terminal region of the Rho GTPase Cdc42 in a patient presenting a severe autoinflammatory phenotype. Methods: We have analyzed the consequences of the mutation on the subcellular localization of the Cdc42 protein using imaging techniques. Molecular studies were performed using proteomic and biochemical experiments to provide mechanistic bases of the observed defects. Functional assays were also conducted using flow cytometry and cytokine production measurements. Results: We show that mutant Cdc42 is trapped in the Golgi apparatus due to the aberrant addition of a palmitate that both enhances the interaction of mutant Cdc42 with Golgi membranes and inhibit its extraction by GDP dissociation inhibitor (GDI), thus impairing its cytosol/membrane shuttling. At the functional level, mutant Cdc42 fails to sustain actin filaments polymerization and induces an exacerbated profile of pro-inflammatory cytokine production due to increased NF-kB activation. Conclusions: Our study now provides a molecular explanation for mutations that have been identified recently in our AID patient and others in the C-terminal part of Cdc42. Mutations located in this region of Cdc42 impair the intracellular localization of Cdc42, preventing its interaction with the plasma membrane. Thus, our results definitively link mutations in the CDC42 gene to a complex immune-hemato-autoinflammatory phenotype in humans.

Abstract T lymphocyte migration is an essential step to mounting an efficient immune response. The rapid and random motility of these cells which favors their sentinel role is conditioned by chemokines as well as by the physical environment. Morphological changes, underlaid by dynamic actin cytoskeleton remodeling, are observed throughout migration but especially when the cell modifies its trajectory. Using dynamic cell imaging, we investigated the signaling pathways involved in T cell directionality control. We monitored cAMP variation concomitantly with actin distribution upon T lymphocyte migration and highlighted the fact that spontaneous bursts in cAMP starting from the leading edge, are sufficient to promote stable actin redistribution triggering trajectory modification.

Most autoinflammatory diseases are caused by mutations in innate immunity genes. Recently, four variants in the RHO GTPase CDC42 were discovered in patients affected by syndromes generally characterized by neonatal-onset of cytopenia and auto-inflammation, including hemophagocytic lymphohistiocytosis and rash in the most severe form (NOCARH syndrome). However, the mechanisms responsible for these phenotypes remain largely elusive. Here, we show that the recurrent p.R186C CDC42 variant, which is trapped in the Golgi apparatus, elicits a block in both anterograde and retrograde transports, and endoplasmic reticulum stress. Consequently, it favors STING accumulation in the Golgi in a COPI-dependent manner. This is also observed for the other Golgi-trapped p.*192C*24 CDC42 variant, but not for the p.Y64C and p.C188Y variants that do not accumulate in the Golgi. We demonstrate that the two Golgi-trapped CDC42 variants are the only ones that exhibit overactivation of the STING pathway. Consistent with these results, patients carrying Golgi-trapped CDC42 mutants present very high levels of circulating IFNα at the onset of their disease. Thus, we report new mechanistic insights on the impact of the Golgi-trapped CDC42 variants. This increase in STING activation provides a rationale for combination treatments for these severe cases.

Background: CDC42 belongs to the RHO GTPases family. Recently, four variants were identified in autoinflammatory patients. One variant affects the N-terminal part of the protein while the three others are located in the C-terminal region. To date, most of the functional defects were only reported for the C-terminal R186C variant. The other three variants are far less characterized at the functional level. Objectives: We aimed to investigate whether all four CDC42 variants share common signaling alterations. Methods: We performed in depth imaging analysis of actin cytoskeleton and NF-kB nuclear translocation, coupled to flow cytometry in cells from patients or in the monocytic THP-1 cell line. Results: We show that the N-terminal Y64C CDC42 variant localizes normally in cells and does not exhibit any defect in actin filaments formation or NF-kB activation. By contrast, all three C-terminal CDC42 variants have aberrant subcellular localizations and share common functional alterations. They exhibit a strong reduction or complete block in their abilities to polymerize actin filaments. They also show more NF-kB nuclear translocation and phosphorylation. However, we suggest that there is no causal relationship between these two events. Artificial reduction in cellular actin content using specific pharmacologic drugs is indeed not sufficient to hyperactivate NF-kB. Conclusions: This study further extends the spectrum of defects observed in autoinflammatory CDC42 patients, and pinpoints a functional heterogeneity between N- and C-terminal CDC42 variants. We also show that CDC42 patients should not be necessarily classified among actinopathies. Altogether, the functional defects we report here can lead the way towards more personalized therapeutic interventions.