ABSTRACT Atherosclerotic vascular disease resulting from unstable plaques is the leading cause of morbidity and mortality in subjects with type 2 diabetes (T2D), and thus a major therapeutic goal is to discover T2D drugs that can also promote atherosclerotic plaque stability. Genetic or pharmacologic inhibition of mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase-2 (MK2) in obese mice improves glucose homeostasis and enhances insulin sensitivity. We developed two novel orally active small-molecule inhibitors of MK2, TBX-1 and TBX-2, and tested their effects on metabolism and atherosclerosis in high-fat Western diet (WD)-fed Ldlr -/- mice. Ldlr -/- mice were first fed the WD to allow atherosclerotic lesions to become established, and the mice were then treated with TBX-1 or TBX-2. Both compounds improved glucose metabolism and lowered plasma cholesterol and triglyceride, without an effect on body weight. Most importantly, the compounds decreased lesion area, lessened plaque necrosis, and increased fibrous cap thickness in the aortic root lesions of the mice. Thus, in a preclinical model of high-fat feeding and established atherosclerosis, MK2 inhibitors improved metabolism and also enhanced atherosclerotic plaque stability, suggesting potential for further clinical development to address the epidemic of T2D associated with atherosclerotic vascular disease.

Abstracts Phagocytic clearance of dying cells, termed efferocytosis, must occur efficiently to maintain homeostasis and prevent disease. Yet, our understanding of this important biological process remains incomplete. To search for novel regulators of efferocytosis, we performed a FACS-based genome-wide CRISPR knockout screen in primary murine macrophages. We identified a novel role for WDFY3 in efferocytosis by macrophages. WDFY3 deficiency in macrophages specifically impaired uptake, not binding, of apoptotic cells due to defective actin depolymerization. We further revealed that WDFY3 directly interacts with GABARAP, thus facilitating LC3 lipidation and subsequent lysosomal acidification to permit the degradation of apoptotic cell components. Although the C-terminus of WDFY3 was sufficient to rescue impaired degradation, full-length WDFY3 is still required for regulating uptake. Finally, WDFY3 is required for efficient efferocytosis in vivo in mice and in primary human macrophages. The work expands our knowledge of the mechanisms of macrophage efferocytosis, and more broadly, provides a general strategy for genome-wide CRISPR screen to interrogate complex functional phenotypes in primary macrophages. Highlights Functional readout for pooled genome-wide CRISPR screen in primary macrophages. WDFY3 is discovered as a regulator of macrophage efferocytosis in vitro and in vivo . WDFY3 deficiency led to impaired uptake, as opposed to binding, of apoptotic cells due to defective actin depolymerization. WDFY3 directly interacts with GABARAP, facilitating LC3 lipidation and subsequent lysosomal acidification to permit the degradation of apoptotic cell components. C-terminal WDFY3 is sufficient to regulate the degradation of engulfed apoptotic cells while full-length WDFY is required for regulating uptake.

ABSTRACT Impairments in carbohydrate, lipid, and amino acid metabolism drive features of plaque instability. However, where these impairments occur within the atheroma remains largely unknown. Therefore, we sought to characterize the spatial distribution of metabolites within stable and unstable atherosclerosis in both the fibrous cap and necrotic core. Atherosclerotic tissue specimens were scored based on the Stary classification scale and subdivided into stable and unstable atheromas. After performing mass spectrometry imaging (MSI) on these samples, we identified over 850 metabolite-related peaks. Using MetaboScape, METASPACE, and HMDB, we confidently annotated 170 of these metabolites and found over 60 of these were different between stable and unstable atheroma. We then integrated these results with an RNA-sequencing dataset comparing stable and unstable human atherosclerosis. Upon integrating our MSI results with the RNA-seq dataset, we discovered that pathways related to lipid metabolism and long-chain fatty acids were enriched in stable plaques, whereas reactive oxygen species, aromatic amino acid, and tryptophan metabolism were increased in unstable plaques. Acylcarnitines and acylglycines were increased in stable plaques whereas tryptophan metabolites were enriched in unstable plaques. Evaluating spatial differences in stable plaques revealed lactic acid in the necrotic core, whereas pyruvic acid was elevated in the fibrous cap. In unstable plaques, 5-hydroxyindole-acetic acid was enriched in the fibrous cap. Our work herein represents the first step to defining an atlas of metabolic pathways involved in plaque destabilization in human atherosclerosis. We anticipate this will be a valuable resource and open new avenues of research in cardiovascular disease. GRAPHICAL ABSTRACT

Abstract Background and aims Hepatocyte apoptosis is a key feature of non-alcoholic steatohepatitis (NASH), but the fate of apoptotic hepatocytes in NASH is poorly understood. Herein we explore the hypothesis that impaired TIM4-mediated clearance of dead hepatocytes by liver macrophages (efferocytosis) is impaired in NASH and drives the progression to liver fibrosis. Methods Kupffer cell (KC)-TIM4 expression and efferocytosis were assayed in normal and NASH liver from humans and diet-induced NASH mice. The engulfment of human and mouse apoptotic hepatocytes by primary human and mouse liver KCs was assayed ex vivo . Causation was assessed in NASH mice using anti-TIM4 antibodies, KC-TIM4-knockout, or inducible KC-TIM4 expression, with analyses focused on efferocytosis of apoptotic hepatocytes by liver macrophages and liver fibrosis. Results In human and mouse NASH liver, apoptotic hepatocytes accumulated and was associated with the loss of the KC efferocytosis receptor TIM4. Anti-TIM4 inhibited the engulfment of apoptotic hepatocytes by primary human and mouse liver KCs ex vivo , and anti-TIM4 administration to early NASH mice worsened liver macrophage efferocytosis and accelerated the progression to fibrotic NASH. A similar result was obtained by genetically deleting TIM4 in KCs in NASH mice. Most importantly, genetic restoration of macrophage TIM4 in NASH mice enhanced the clearance of apoptotic hepatocytes by liver macrophages and decreased liver fibrosis. Conclusions The loss of macrophage TIM4 that occurs during NASH progression impairs the clearance of apoptotic hepatocytes by liver macrophages, which subsequently promotes the progression to fibrotic NASH. This pathogenic sequence of events can be prevented by restoring macrophage TIM4, suggesting that future therapeutic approaches designed to boost TIM4 expression in liver macrophages could represent a novel strategy to prevent fibrotic NASH progression. Lay summary Nonalcoholic steatohepatitis (NASH) is emerging as the leading cause of liver disease, but the processes leading to liver fibrosis in NASH, which determines clinical outcome, are incompletely understood. Our study provides evidence impaired clearance of dead liver cells by liver macrophages in NASH, which is due to loss of a macrophage receptor called TIM4, contributes to liver fibrosis. Knowledge of this process may suggest new ways to bolster the clearance of dead liver cells in NASH and thereby prevent the progression to liver fibrosis and subsequent liver disease.

Abstract Macrophages are critical to maintaining and restoring tissue homeostasis during inflammation. The lipid metabolic state of macrophages influences their function, but a deeper understanding of how lipid metabolism is regulated in pro-resolving macrophage responses is needed. Lipin-1 is a phosphatidic acid phosphatase with a transcriptional coregulatory activity (TC) that regulates lipid metabolism. We previously demonstrated that lipin-1 supports pro-resolving macrophage responses, and here, myeloid-associated lipin-1 is required for inflammation resolution, yet how lipin-1-regulated cellular mechanisms promote macrophage pro-resolution responses is unknown. We demonstrated that the loss of lipin-1 in macrophages led to increased free fatty acid, neutral lipid, and ceramide content and increased phosphorylation of acetyl-CoA carboxylase. The inhibition of the first step of lipid synthesis and transport of citrate from the mitochondria in macrophages reduced lipid content and restored efferocytosis and inflammation resolution in lipin-1 m KO macrophages and mice. Our findings suggest macrophage-associated lipin-1 restrains lipid synthesis, promoting pro-resolving macrophage function in response to pro-resolving stimuli. Teaser Lipin 1 blockade of lipid biosynthesis inducing mitochondrial citrate export promotes efferocytosis and inflammation resolution.

The effective removal of apoptotic cells (ACs) by macrophages, termed “efferocytosis”, is essential for resolving inflammation and promoting tissue repair. Accordingly, impaired efferocytosis underlies chronic diseases, such as atherosclerosis, and underscores the need to restore this process. Pro-resolving macrophages execute successive rounds of efferocytosis and produce the pro-resolving polyamine putrescine, which is critically regulated by its rate-limiting enzyme ornithine decarboxylase (ODC1). Despite valuable insights, critical gaps remain in our understanding of how putrescine biosynthesis is regulated during inflammation resolution. Therefore, we sought to explore the mechanisms underlying the signaling pathways governing ODC1 gene expression, putrescine biosynthesis, and their role in inflammation resolution and atherosclerosis regression. We found that ODC1 expression in lesional macrophages decreased during atherosclerosis progression ( Ldlr -/- mice fed a high-fat, Western-type diet (HFD) for 16 weeks), whereas ODC1 expression substantially increased during atherosclerosis regression ( Ldlr -/- mice fed an HFD for 16 weeks then treated with a virus that restores hepatic LDLR and switched to normal chow for 5 more weeks). Consistently, early-stage human atherosclerotic plaques (Type 1-2) showed high levels of ODC1 in CD68 + macrophages, yet lesional macrophages in advanced-stage human atheromas (Type 3-5) showed low levels of ODC1. In vitro studies in humans and mice indicated that engulfment of ACs enhanced ODC1 expression, which was unaffected by AC binding or its degradation. However, blocking actin polymerization prevented ODC1 upregulation by apoptotic cells whereas stimulating its polymerization enhanced ODC1 expression. Furthermore, uptake of inert beads similarly increased ODC1 expression, relying on a novel pathway involving integrin αV-mediated Stat3 activation and Myc-dependent Odc1 transcription. These newly identified mechanisms illuminate previously unknown mechanisms driving inflammation resolution and reveal new avenues for developing targeted therapies in atherosclerotic cardiovascular disease.

Despite significant advances in diagnosing and treating cardiovascular disease, atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide. While most atherosclerotic plaques remain asymptomatic, a subset can lead to myocardial infarction, stroke, or sudden death. A plethora of evidence has demonstrated that rupture-prone atheromas contains a large necrotic core owed to defective efferocytosis, the process by which apoptotic cells (ACs) are engulfed and cleared by macrophages. The efficient clearance of apoptotic cells blocks post-apoptotic necrosis and prevents the release of tissue-degrading enzymes, immunogenic epitopes, and proinflammatory mediators. As atherosclerosis advances, substantial remodeling of the extracellular matrix (ECM) occurs whereby transitional ECM proteins, notably fibronectin (FN), deposit into the subendothelial matrix normally dominated by collagen IV and laminins. However, whether macrophage interactions with the ECM alters efferocytosis, inflammation resolution, and atherosclerosis remains unknown. Surprisingly, we discovered that macrophage interactions with FN enhance efferocytosis compared to their interactions with basement membrane proteins. Furthermore, we demonstrate that the primary FN receptor, integrin α5β1, is required for FN-mediated efferocytosis and TIM3 expression, (encoded by Havcr2 ), a known phosphatidylserine receptor that binds to ACs. Moreover, treating mice with established atherosclerosis with the integrin α5β1 antagonistic peptide ATN-161 reduced TIM3 expression in macrophages and expanded necrotic core formation. We also found lesional macrophages from human unstable atheromas displayed significantly lower TIM3 expression compared to macrophages within stable plaques. In a mouse model of atherosclerosis regression, where atherogenic stimuli dissipate, efferocytosis is restored, and FN remains, lesional macrophages showed a substantial increase in TIM3 expression. Thus, while FN is traditionally considered atherogenic in endothelial and smooth muscle cells in the initial stages of atherosclerosis, our data uncovers that macrophage adhesion to FN upregulates TIM3 expression, mediating efferocytosis and promoting features of plaque stability.