The Drosophila larva has been used to investigate many processes in cell biology, including morphogenesis, physiology, responses to drugs and new therapeutic compounds. Despite its enormous potential as a model system, it has technical limitations in cases where longer-term live imaging is necessary, because of the lack of efficient methods for immobilising larvae for extended periods. We describe here a simple procedure for anaesthetisation and long-term in vivo imaging of the epidermis and other larval organs including gut, imaginal discs, neurons, fat body, tracheae and haemocytes, and show a procedure for probing cell properties by laser ablation. We include a survey of different anaesthetics, showing that short exposure to diethyl ether is the most effective for long-term immobilisation of larvae. This method does not require specific expertise beyond basic Drosophila genetics and husbandry, and confocal microscopy. It enables high-resolution studies of many systemic and sub-cellular processes in larvae.

Mitochondrial DNA is exposed to multiple insults produced by normal cellular function. Upon mtDNA replication stress the mitochondrial genome transfers to endosomes where it is degraded. Here, using proximity proteomics we found that mtDNA replication stress leads to the rewiring of the mitochondrial proximity proteome, increasing mitochondria association with lysosomal and vesicle-associated proteins, such as the GTPase RAB10 and the retromer. We found that upon mtDNA replication stress, RAB10 enhances mitochondrial fragmentation and relocates from the ER to lysosomes containing mtDNA. The retromer enhances and coordinates the expulsion of mitochondrial matrix components through mitochondrial-derived vesicles, and mtDNA with direct transfer to lysosomes. Using a Drosophila model carrying a long deletion on the mtDNA (ΔmtDNA), we evaluated in vivo the role of the retromer in mtDNA extraction and turnover in the larval epidermis. The presence of ΔmtDNA elicits the activation of a specific transcriptome profile related to counteract mitochondrial damage. Expression of the retromer component Vps35 is sufficient to restore mtDNA homoplasmy and mitochondrial defects associated with ΔmtDNA. Our data reveal novel regulators involved in the specific elimination of mtDNA. We demonstrate that modulation of the retromer in vivo is a successful mechanism to restore mitochondrial function associated with mtDNA damage.

Abstract Epithelial wound healing in Drosophila involves the formation of multinucleate cells surrounding the wound. We show that autophagy, a cellular degradation process often deployed in stress responses, is required for the formation of a multinucleated syncytium during wound healing. In addition, uncontrolled autophagy in the unwounded epidermis leads to the degradation of endo-membranes and the lateral plasma membrane, while the apical and basal membranes and the epithelial barrier function remain intact. Proper functioning of TORC1 is needed to prevent autophagy from destroying the larval epidermis, which depends on membrane isolation and phagophore expansion, but does not require the fusion of autophagosomes to lysosomes. Our findings reveal a function for TORC1-mediated regulation of autophagy in maintaining membrane integrity and homeostasis in the epidermis and during wound healing. Finally, autophagy can counteract experimentally induced nuclear defects resembling laminopathies. Key findings A novel role for TORC1/autophagy pathway to control plasma membrane integrity and homeostasis. Autophagy as the only known necessary and sufficient inducer of syncytium formation in the epithelium and during wound healing.