The crumbs protein of Drosophila is an integral membrane protein, with 30 EGF-like and 4 laminin A G domain-like repeats in its extracellular segment, which is expressed on the apical plasma membrane of all ectodermally derived epithelia. Here, we present evidence to show that the insertion of crumbs into the plasma membrane is necessary and sufficient to confer apical character on a membrane domain. Overexpression of crumbs results in an enormous expansion of the apical plasma membrane and the concomitant reduction of the basolateral domain. This is followed by the redistribution of beta Heavy-spectrin, a component of the membrane cytoskeleton, and by the ectopic deposition of cuticle and other apical components into these areas. Strikingly, overexpression of the membrane-bound cytoplasmic portion of crumbs alone is sufficient to produce this dominant phenotype. Our results suggest that crumbs plays a key role in specifying the apical plasma membrane domain of ectodermal epithelial cells of Drosophila.

The establishment and maintenance of polarity is of fundamental importance for the function of epithelial and neuronal cells. In Drosophila, the multi-PDZ domain protein Bazooka (Baz) is required for establishment of apico-basal polarity in epithelia and in neuroblasts, the stem cells of the central nervous system. In the latter, Baz anchors Inscuteable in the apical cytocortex, which is essential for asymmetric localization of cell fate determinants and for proper orientation of the mitotic spindle. Here we show that Baz directly binds to the Drosophila atypical isoform of protein kinase C and that both proteins are mutually dependent on each other for correct apical localization. Loss-of-function mutants of the Drosophila atypical isoform of PKC show loss of apico-basal polarity, multilayering of epithelia, mislocalization of Inscuteable and abnormal spindle orientation in neuroblasts. Together, these data provide strong evidence for the existence of an evolutionary conserved mechanism that controls apico-basal polarity in epithelia and neuronal stem cells. This study is the first functional analysis of an atypical protein kinase C isoform using a loss-of-function allele in a genetically tractable organism.

Wingless (Wg) is an important signaling molecule in the development of Drosophila, but little is known about its signal transduction pathway. Genetic evidence indicates that another segment polarity gene, dishevelled (dsh) is required for Wg signaling. We have recently developed a cell culture system for Wg protein activity, and using this in vitro system as well as intact Drosophila embryos, we have analyzed biochemical changes in the Dsh protein as a consequence of Wg signaling. We find that Dsh is a phosphoprotein, normally present in the cytoplasm. Wg signaling generates a hyperphosphorylated form of Dsh, which is associated with a membrane fraction. Overexpressed Dsh becomes hyperphosphorylated in the absence of extracellular Wg and increases levels of the Armadillo protein, thereby mimicking the Wg signal. A deletional analysis of Dsh identifies several conserved domains essential for activity, among which is a so-called GLGF/DHR motif. We conclude that dsh, a highly conserved gene, is not merely a permissive factor in Wg signaling but encodes a novel signal transduction molecule, which may function between the Wg receptor and more downstream signaling molecules.

Protein trafficking in the secretory pathway, for example the secretion of Wnt proteins, requires tight regulation. These ligands activate Wnt signaling pathways and are crucially involved in development and disease. Wnt is transported to the plasma membrane by its cargo receptor Evi, where Wnt/Evi complexes are endocytosed and sorted onto exosomes for long-range secretion. However, the trafficking steps within the endosomal compartment are not fully understood. The promiscuous SNARE Ykt6 folds into an auto-inhibiting conformation in the cytosol, but a portion associates with membranes by its farnesylated and palmitoylated C-terminus. Here, we demonstrate that membrane detachment of Ykt6 is essential for exosomal Wnt secretion. We identified conserved phosphorylation sites within the SNARE domain of Ykt6, which block Ykt6 cycling from the membrane to the cytosol. In Drosophila, Ykt6-RNAi mediated block of Wg secretion is rescued by wildtype but not phosphomimicking Ykt6. The latter accumulates at membranes, while wildtype Ykt6 regulates Wnt trafficking between the plasma membrane and multivesicular bodies. Taken together, we show that a regulatory switch in Ykt6 fine-tunes sorting of Wnts in endosomes.

Mitochondrial DNA is exposed to multiple insults produced by normal cellular function. Upon mtDNA replication stress the mitochondrial genome transfers to endosomes where it is degraded. Here, using proximity proteomics we found that mtDNA replication stress leads to the rewiring of the mitochondrial proximity proteome, increasing mitochondria association with lysosomal and vesicle-associated proteins, such as the GTPase RAB10 and the retromer. We found that upon mtDNA replication stress, RAB10 enhances mitochondrial fragmentation and relocates from the ER to lysosomes containing mtDNA. The retromer enhances and coordinates the expulsion of mitochondrial matrix components through mitochondrial-derived vesicles, and mtDNA with direct transfer to lysosomes. Using a Drosophila model carrying a long deletion on the mtDNA (ΔmtDNA), we evaluated in vivo the role of the retromer in mtDNA extraction and turnover in the larval epidermis. The presence of ΔmtDNA elicits the activation of a specific transcriptome profile related to counteract mitochondrial damage. Expression of the retromer component Vps35 is sufficient to restore mtDNA homoplasmy and mitochondrial defects associated with ΔmtDNA. Our data reveal novel regulators involved in the specific elimination of mtDNA. We demonstrate that modulation of the retromer in vivo is a successful mechanism to restore mitochondrial function associated with mtDNA damage.

Glomerular diseases are a major cause for chronic kidney disorders. In the majority of cases podocyte injury is causative for disease development. Cytoskeletal rearrangements and morphological changes are hallmark features of podocyte injury and result in dedifferentiation and subsequent loss of podocytes. Here, we establish a link between components of the Par3 polarity complex and actin regulators, which are necessary to establish and maintain the podocytes architecture utilizing both, mouse and Drosophila models. We demonstrate that the two mammalian Par3 proteins, Par3A and Par3B, share redundant functions despite differing in their ability to interact with other components of the Par complex. Only simultaneous inactivation of both Par3 proteins causes a severe disease phenotype in mouse podocytes by regulating Rho-GTP levels involving the actin regulators Synaptopodin and CD2AP in an aPKC independent manner.

Abstract Bazooka/Par-3 (Baz) is an evolutionarily conserved scaffold protein that together with its binding partners atypical protein kinase C (aPKC) and Par-6 forms the Par complex. This protein complex functions as a master regulator for the establishment and maintenance of cell polarity in many different cell types. In the vast majority of published research papers Par complex members have been reported to localize at the cell cortex and at intercellular junctions. However, there have also been several reports claiming localization and function of Par complex members at additional subcellular sites, in particular the nucleus, the nuclear envelope and the neuromuscular junction. In this study we have re-assessed this issue for Baz in a systematic manner. We used a variety of antibodies raised in different host animals against different epitopes of Baz for confocal imaging of Drosophila tissues. We tested the specificity of these antisera by using mosaic analysis with null mutant baz alleles and tissue-specific RNAi against baz. In addition, we used a GFP-tagged gene trap line for Baz and a bacterial artificial chromosome (BAC) expressing GFP-tagged Baz under control of its endogenous promoter in a baz null mutant background to compare the subcellular localization of the respective GFP-Baz fusion proteins to the staining results with anti-Baz antisera. Together, these experiments did not provide any evidence for specific localization of Baz to the nucleus or the neuromuscular junction.