ABSTRACT Vascular dysfunction contributes to the pro-oncogenic tumor microenvironment and impedes the delivery of therapeutics. Normalizing of the tumor vasculature has therefore become a potential therapeutic objective. We previously reported that the secreted glycoprotein, leucine-rich α-2-glycoprotein 1 (LRG1), contributes to the formation of pathogenic neovascularization. Here we show that in mouse models of cancer, Lrg1 is induced in tumor endothelial cells. We demonstrate that the expression of LRG1 impacts on tumor progression as Lrg1 deletion or treatment with a LRG1 function-blocking antibody inhibited tumor growth and improved survival. Inhibition of LRG1 increased endothelial cell pericyte coverage and improved vascular function resulting in significantly enhanced efficacy of cisplatin chemotherapy, adoptive T-cell therapy and immune checkpoint inhibition (anti-PD1) therapy. With immunotherapy, LRG1 inhibition led to a significant shift in the tumor microenvironment from being predominantly immune silent (cold) to immune active (hot). LRG1 therefore drives vascular abnormalization and its inhibition represents a novel and effective means of improving the efficacy of cancer therapeutics.

Epithelial tissues use homeostatic defence mechanisms to actively expel aberrant or genetically mutant cells and prevent disease. When present in healthy tissues in low numbers, we show that cells expressing cancer-causing mutations (KrasG12D, p53R172H) compete with normal cells for survival and are often eliminated. Thus, tumour initiation must require mechanisms whereby mutant cells override tissue defence mechanisms to remain in a tissue; however, the biology of these initial events is poorly understood. Here, we use an in vivo model of sporadic tumorigenesis in the adult pancreas to show that a population of KrasG12D- or p53R172H-expressing cells are never eliminated from the epithelium. Using RNA sequencing of non-eliminated populations and quantitative fluorescence imaging, we show that beta-catenin-independent Wnt5a signalling, and cell dormancy are key features of surviving KrasG12D cells in vivo. We demonstrate that Wnt5a (and not Wnt3a) inhibits apical extrusion of RasV12 cells in vitro by promoting stable E-cadherin-based cell-cell adhesions at RasV12-normal cell-cell boundaries. Inhibition of Wnt5a signalling restores E-cadherin dynamics at normal-mutant boundaries and apical extrusion in vitro. RasV12 cells arrested in the cell cycle are not extruded and this is rescued when Wnt signalling is inhibited. In the pancreas, Wnt signalling, E-cadherin and beta-catenin are increased at cell-cell contacts between non-eliminated KrasG12D cells and normal neighbours. Importantly, we demonstrate that active Wnt signalling is a general mechanism required to promote KrasG12D and p53R172H cell survival in vivo. Treatment with porcupine inhibitor rescues pancreas tissue defence by switching mutant cell retention to cell expulsion. Our results suggest that RAS mutant cells activate Wnt and a dormant cell state to avoid cell expulsion and to survive in the adult pancreas.

Summary As we age, our tissues are repeatedly challenged by mutational insult, yet cancer occurrence is a relatively rare event. Cells carrying cancer-causing genetic mutations compete with normal neighbours for space and survival in tissues. However, the mechanisms underlying mutant-normal competition in adult tissues and the relevance of this process to cancer remain incompletely understood. Here, we investigate how the adult pancreas maintains tissue health in vivo following sporadic expression of oncogenic Kras ( KrasG12D ), the key driver mutation in human pancreatic cancer. We find that when present in tissues in low numbers, KrasG12D mutant cells are outcompeted and cleared from exocrine and endocrine compartments in vivo . Using quantitative 3D tissue imaging, we show that prior to being cleared, KrasG12D cells lose cell volume, segregate from normal cells and decrease E-cadherin-based cell-cell adhesions with normal neighbours. We identify EphA2 receptor is an essential signal in the clearance of KrasG12D cells from exocrine and endocrine tissues in vivo . In the absence of functional EphA2, KrasG12D cells no longer segregate, E-cadherin-based cell-cell adhesions increase and KrasG12D cells are retained in tissues. Retention of KRasG12D cells leads to an increased burden of premalignant pancreatic intraepithelial neoplasia (PanINs) in tissues. Our data show that adult pancreas tissues remodel to clear KrasG12D cells and maintain tissue health. This study provides evidence to support a conserved functional role of EphA2 in Ras-driven cell competition in epithelial tissues and suggests that EphA2 is a novel tumour suppressor in pancreatic cancer.