The ATP-driven bicarbonate transporter 1 (BCT1), a four-component complex in the cyanobacteria CO 2 concentrating mechanism, could enhance photosynthetic CO 2 assimilation in plant chloroplasts. However, directing its subunits (CmpA, CmpB, CmpC and CmpD) to three chloroplast sub-compartments is highly complex. Investigating BCT1 integration into Nicotiana benthamiana chloroplasts revealed promising targeting strategies using transit peptides from the intermembrane space protein Tic22 for correct CmpA targeting, while the transit peptide of the chloroplastic ABCD2 transporter effectively targeted CmpB to the inner envelope membrane. CmpC and CmpD were targeted to the stroma by RecA and recruited to the inner envelope membrane by CmpB. Despite successful targeting, expression of this complex in CO 2 -dependent Escherichia coli failed to demonstrate bicarbonate uptake. We then used rational design and directed evolution to generate new BCT1 forms that were constitutively active. Several mutants were recovered, including a CmpCD fusion. Selected mutants were further characterized and stably expressed in Arabidopsis thaliana , but the transformed plants did not have higher carbon assimilation rates or decreased CO 2 compensation points in mature leaves. While further analysis is required, this directed evolution and heterologous testing approach presents potential for iterative modification and assessment of CO 2 concentrating mechanism components to improve plant photosynthesis.

Abstract Translation of psbA , the chloroplast gene that encodes the D1 subunit of Photosystem II (PSII), is important for both PSII biogenesis and repair. The translation of the psbA transcript in the chloroplast is under the control of nuclear gene products. Using a Chlamydomonas forward genetic screen and whole genome sequencing, we found a mutant defective in PSII activity and mapped the causative gene to be the homolog of Arabidopsis High Fluorescence ( HCF244 ) gene, or CrHCF244 . We then demonstrated that CrHCF244 is required for psbA translation in the alga, consistent with the function of HCF244 in Arabidopsis . The Arabidopsis HCF244 gene also complemented the algal mutant. These results experimentally support the functional conservation of the homologs in green algae and land plants. However, these studies also revealed differences in psbA translation in Chlamydomonas and Arabidopsis . Loss of HCF244 in Arabidopsis results in a large decrease in chlorophyll. In contrast, there is no significant loss of chlorophyll in Chlamydomonas when CrHCF244 is knocked out. This observation supports the uncoupling of D1 translation and chlorophyll association in algae as reported recently in an ohp2 mutant, which is defective in chlorophyll delivery. Intriguingly, the CrHCF244 mutant also exhibited a relatively high rate of suppressor mutants, pointing to the presence of alternative pathway(s) for D1 translation control. The characterization of both the conserved aspects and the differences in psbA translation control between algae and plants will help elucidate how this process is regulated. Highlight We identified CrHCF244 as a translation factor of psbA in Chlamydomonas . Characterization of this protein and genetic examinations of other previously identified psbA translation factors in Chlamydomonas reveal similarities and differences in psbA translation between Chlamydomonas and Arabidopsis .