Anti-tumour inflammatory cytokines are highly toxic when administered systemically. Here, in multiple syngeneic mouse models, we show that the intratumoural injection of recombinantly expressed cytokines bound tightly to the common vaccine adjuvant aluminium hydroxide (alum) (via ligand exchange between hydroxyls on the surface of alum and phosphoserine residues tagged to the cytokine by an alum-binding peptide) leads to weeks-long retention of the cytokines in the tumours, with minimal side effects. Specifically, a single dose of alum-tethered interleukin-12 induced substantial interferon-γ-mediated T-cell and natural-killer-cell activities in murine melanoma tumours, increased tumour antigen accumulation in draining lymph nodes and elicited robust tumour-specific T-cell priming. Moreover, intratumoural injection of alum-anchored cytokines enhanced responses to checkpoint blockade, promoting cures in distinct poorly immunogenic syngeneic tumour models and eliciting control over metastases and distant untreated lesions. Intratumoural treatment with alum-anchored cytokines represents a safer and tumour-agnostic strategy to improving local and systemic anticancer immunity.

Monoclonal antibodies targeting the programmed cell death protein 1 (PD-1) remain the most prevalent cancer immunotherapy both as a monotherapy and in combination with additional therapies. Despite the extensive success of anti-PD-1 monoclonal antibodies in the clinic, the experimental relationship between binding affinity and functional potency for anti-PD-1 antibodies in vivo has not been reported. Anti-PD-1 antibodies with higher and lower affinity than nivolumab or pembrolizumab are entering the clinic and show varied preclinical efficacy. Here, we explore the role of broad-ranging affinity variation within a single lineage in a syngeneic immunocompetent mouse model. By developing a panel of murine anti-PD-1 antibodies with varying affinity (ranging from KD = 20 pM - 15 nM), we find that there is a threshold affinity required for maximum efficacy at a given dose in the treatment of the MC38 adenocarcinoma model with anti-PD-1 immunotherapy. Physiologically based pharmacokinetic modeling complements interpretation of the experimental results and highlights the direct relationship between dose, affinity, and PD-1 target saturation in the tumor.

Abstract Purpose: Cytokines IL2 and IL12 exhibit potent anticancer activity but suffer a narrow therapeutic window due to off-tumor immune cell activation. Engineering cytokines with the ability to bind and associate with tumor collagen after intratumoral injection potentiated response without toxicity in mice and was previously safe in pet dogs with sarcoma. Here, we sought to test the efficacy of this approach in dogs with advanced melanoma. Patients and Methods: This study examined 15 client-owned dogs with histologically or cytologically confirmed malignant melanoma that received a single 9-Gy fraction of radiotherapy, followed by six cycles of combined collagen-anchored IL2 and IL12 therapy every 2 weeks. Cytokine dosing followed a 3 + 3 dose escalation design, with the initial cytokine dose chosen from prior evaluation in canine sarcomas. No exclusion criteria for tumor stage or metastatic burden, age, weight, or neuter status were applied for this trial. Results: Median survival regardless of the tumor stage or dose level was 256 days, and 10/13 (76.9%) dogs that completed treatment had CT-measured tumor regression at the treated lesion. In dogs with metastatic disease, 8/13 (61.5%) had partial responses across their combined lesions, which is evidence of locoregional response. Profiling by NanoString of treatment-resistant dogs revealed that B2m loss was predictive of poor response to this therapy. Conclusions: Collectively, these results confirm the ability of locally administered tumor-anchored cytokines to potentiate responses at regional disease sites when combined with radiation. This evidence supports the clinical translation of this approach and highlights the utility of comparative investigation in canine cancers.

Abstract Immune surveillance of the brain is regulated by resident non-neuronal cells and the blood-brain barrier. 1 Dys-regulation of immunosurveillance is a hallmark feature of several diseases 2–5 including brain tumors 6 that interact with and rely heavily on immune cells, 7 suggesting that disrupting the neuroimmunology of tumors could slow their progression. Yet few tools are available to control brain immunology in vivo with local precision, and fewer yet are used for therapeutic intervention. 2 Here, we propose engineered cytokines as a neuroimmune-modulation platform. We demonstrate that the residence time of cytokines in the brain can be tuned by binding them to the extracellular matrix or synthetic scaffolds. We then show that the aluminum hydroxide adjuvant (alum) is retained in the brain >2 weeks. Tethering of inflammatory cytokines such as interleukins (IL) 2 and 12 to alum yields extended neuroinflammation and brain immunosurveillance after intracranial administration, while avoiding systemic toxicity. In mouse models of both immunologically hot and cold brain tumors, the intracranial deposition of alum-tethered cytokines causes significant delay in tumor progression. RNA profiling reveals that engineered cytokines engage both innate and adaptive immunity in the brain. These findings suggest that engineered cytokines can reprogram brain immunosurveillance, informing the development of future therapies for neuroimmune diseases.

ABSTRACT The clinical use of interleukin-2 and -12 cytokines against cancer is limited by their narrow therapeutic windows due to on-target, off-tumor activation of immune cells when delivered systemically. Engineering IL-2 and IL-12 to bind to extracellular matrix collagen allows these cytokines to be retained within tumors after intralesional injection, overcoming these clinical safety challenges. While this approach has potentiated responses in syngeneic mouse tumors without toxicity, the complex tumor-immune interactions in human cancers are difficult to recapitulate in mouse models of cancer. This has driven an increased role for comparative oncology clinical trials in companion (pet) dogs with spontaneous cancers that feature analogous tumor and immune biology to human cancers. Here, we report the results from a dose-escalation clinical trial of intratumoral collagen-binding IL-2 and IL-12 cytokines in pet dogs with malignant melanoma, observing encouraging local and regional responses to therapy that may suggest human clinical benefit with this approach.