Transgenic mouse lines are characterized with Cre recombinase driven by promoters of CNS-specific genes using bacterial artificial chromosome (BAC) constructs. BAC-Cre constructs for 10 genes ( Chat , Th , Slc6a4 , Slc6a2 , Etv1 , Ntsr1 , Drd2 , Drd1 , Pcp2 , and Cmtm5 ) produced 14 lines with Cre expression in specific neuronal and glial populations in the brain. These Cre driver lines add functional utility to the >500 BAC-EGFP (enhanced green fluorescent protein) transgenic mouse lines that are part of the Gene Expression Nervous System Atlas Project.

To analyze the interdependence of neurons and astroglia during central nervous system development, a rapid method for purifying early postnatal cerebellar neurons and astroglia, and recombining them in vitro, has been developed. The influence of neurons on astroglial shape and proliferation has been evaluated with an in vitro model system previously used to describe the role of cerebellar astroglia in neuronal migration and positioning (Hatten, M. E., and R. K. H. Liem, 1981, J. Cell Biol., 90:622-630; and Hatten, M. E., R. K. H. Liem, and C. A. Mason, 1984, J. Cell Biol., 98:193-204. Cerebellar tissue harvested from C57Bl/6J mouse cerebellum on the third or fourth day postnatal was dissociated into a single cell suspension with trypsin, and enriched glial and neuronal fractions were separated with a step gradient of Percoll. Highly purified astroglial and neuronal fractions resulted from subsequently preplanting the cells on a polylysine-coated culture surface. In the absence of neurons, astroglia, identified by staining with antisera raised against purified glial filament protein, assumed a flattened shape and proliferated rapidly. In the absence of astroglia, cerebellar neurons, identified by staining with antisera raised against the nerve growth factor-inducible large external (NILE) glycoprotein and by electron microscopy, formed cellular reaggregates, had markedly impaired neurite outgrowth, and survived poorly. When purified neurons and isolated astroglia were recombined, astroglial proliferation slowed markedly and the flattened shape expressed in the absence of neurons transformed into highly elongated profiles that resembled embryonic forms of cerebellar astroglia. After longer periods (48-72 h) in the presence of neurons, astroglia had "Bergmann-like" or "astrocyte-like" shapes and neurons commonly associated with them. These results suggest that neurons influence the differentiation of astroglia.

Using a polyclonal antibody against postnatal cerebellar cells, we have isolated' a new, brain-specific member of the lipid-binding protein family (BLBP). Members of this family, such as cellular retinoic acid-binding protein, have been shown to carry small hydrophobic signaling molecules between cellular compartments. The expression of BLBP is spatially and temporally correlated with neuronal differentiation in many parts of the mouse CNS, including postnatal cerebellum, embryonic spinal cord, and cerebral cortex. In situ hybridization and immunocytochemistry show that BLBP is transiently expressed in radial glia in both the embryonic ventricular zone and the postnatal cerebellum. Subcellular localization studies by immunoelectron microscopy demonstrate that BLBP is present in the nucleus as well as the cytoplasm. Affinity-purified anti-BLBP antibodies block glial and neuronal differentiation in primary cell cultures, but have no effect on cell proliferation or adhesion. Based on these results, we propose that BLBP is required for the establishment of the radial glial fiber system in developing brain, a system that is necessary for the migration of immature neurons to establish cortical layers.

In vitro studies from our laboratory indicate that granule neurons, purified from early postnatal mouse cerebellum, migrate on astroglial fibers by forming a 'migration junction' with the glial fiber along the length of the neuronal soma and extending a motile 'leading process' in the direction of migration. Similar dynamics are seen for hippocampal neurons migrating along hippocampal astroglial fibers in vitro. In heterotypic recombinations of neurons and glia from mouse cerebellum and rat hippocampus, neurons migrate on astroglial processes with a cytology and neuron glia relationship identical to that of homotypic neuronal migration in vitro. In all four cases, the migrating neuron presents a stereotyped posture, speed and mode of movement, suggesting that glial fibers provide a generic pathway for neuronal migration in developing brain. Studies on the molecular basis of glial-guided migration suggest that astrotactin, a neuronal antigen that functions as a neuron glia-ligand, is likely to play a crucial role in the locomotion of the neuron along glial fibers. The navigation of neurons from glial fibers into cortical layers, in turn, is likely to involve neuron-neuron adhesion ligands.

When grown in the absence of astroglial cells, purified mouse cerebellar granule neurons survive less than 36 hr and do not extend neurites. Here we report that low concentrations of basic fibroblast growth factor (bFGF, 1–25 ng/ml) maintained the viability and promoted the differentiation of purified granule neurons. The effect of bFGF on granule cell neurite outgrowth was dose dependent. Neurite outgrowth was stimulated markedly in the presence of 1–25 ng/ml bFGF, but effects were not seen below 1 ng/ml or above 50 ng/ml. When affinity-purified antibodies against bFGF (1–5 μg/ml) were added either to purified granule cells or to co-cultures of neurons and astroglial cells, process extension by granule neurons was severely impaired. The inhibition of neurite outgrowth in the presence of anti-bFGF antibodies was reversed by the addition of 25 ng/ml of exogenous bFGF. In addition to neuronotrophic effects, bFGF influenced the rate of growth of the astroglial cells. This result depended on whether the astroglia were grown in isolation from neurons, where low doses of bFGF (10–25 ng) stimulated glial growth, or in coculture with neurons, where much higher doses of bFGF (100–250 ng/ml) were needed for glial mitogenesis. Immunoprecipitation of lysates from 35S-labeled cerebellar astroglial cells with anti-bFGF antibodies revealed a single band after SDS-PAGE at 18,000 Da, the molecular weight of bFGF. These results indicate that glial cells synthesize bFGF and are possibly an endogenous source of bFGF in cerebellar cultures. Thus, astroglial cells synthesize soluble factors needed for neuronal differentiation.

Disrupted-in-Schizophrenia-1 ( DISC-1 ) is a gene whose mutant truncation is associated with major psychiatric illness with a predominance of schizophrenic symptomatology. We have cloned and characterized rodent DISC-1. DISC-1 expression displays pronounced developmental regulation with the highest levels in late embryonic life when the cerebral cortex develops. In yeast two-hybrid analyses, DISC-1 interacts with a variety of cytoskeletal proteins. One of these, NudE-like (NUDEL), is associated with cortical development and is linked to LIS-1, the disease gene for a form of lissencephaly, a disorder of cortical development. The disease mutant form of DISC-1 fails to bind NUDEL. Expression of mutant, but not wild-type, DISC-1 in PC12 cells reduces neurite extension. As schizophrenia is thought to reflect defects in cortical development that are determined by cytoskeletal protein activities, the cellular disturbances we observe with mutant DISC-1 may be relevant to psychopathologic mechanisms.

Astrotactin 2 (ASTN2) is a transmembrane neuronal protein highly expressed in the cerebellum that functions in receptor trafficking and modulates cerebellar Purkinje cell (PC) synaptic activity. We recently reported a family with a paternally inherited intragenic ASTN2 duplication with a range of neurodevelopmental disorders, including autism spectrum disorder (ASD), learning difficulties, and speech and language delay. To provide a genetic model for the role of the cerebellum in ASD-related behaviors and study the role of ASTN2 in cerebellar circuit function, we generated global and PC-specific conditional Astn2 knockout (KO and cKO, respectively) mouse lines. Astn2 KO mice exhibit strong ASD-related behavioral phenotypes, including a marked decrease in separation-induced pup ultrasonic vocalization calls, hyperactivity and repetitive behaviors, altered social behaviors, and impaired cerebellar-dependent eyeblink conditioning. Hyperactivity and repetitive behaviors were also prominent in Astn2 cKO animals. By Golgi staining, Astn2 KO PCs have region-specific changes in dendritic spine density and filopodia numbers. Proteomic analysis of Astn2 KO cerebellum reveals a marked upregulation of ASTN2 family member, ASTN1, a neuron-glial adhesion protein. Immunohistochemistry and electron microscopy demonstrate a large increase in Bergmann glia volume in the molecular layer of Astn2 KO animals. Electrophysiological experiments indicate a reduced frequency of spontaneous excitatory postsynaptic currents (EPSCs), as well as increased amplitudes of both spontaneous EPSCs and inhibitory postsynaptic currents (IPSCs) in the Astn2 KO animals, suggesting that pre- and postsynaptic components of synaptic transmission are altered. Thus, ASTN2 regulates ASD-like behaviors and cerebellar circuit properties.

Comparative transcriptomics between differentiating human pluripotent stem cells (hPSC) and developing mouse neurons offers a powerful approach to compare genetic and epigenetic pathways in human and mouse neurons. To analyze human Purkinje cell (PC) differentiation, we optimized a protocol to generate hPSC-PCs that formed synapses when cultured with mouse cerebellar glia and granule cells and fired large calcium currents, measured with the genetically encoded calcium indicator jRGECO1a. To directly compare global gene expression of hPSC-PCs with developing mouse PCs, we used translating ribosomal affinity purification (TRAP). As a first step, we used Tg(Pcp2-L10a-Egfp) TRAP mice to profile actively transcribed genes in developing postnatal mouse PCs, and used metagene projection to identify the most salient patterns of PC gene expression over time. We then created a transgenic Pcp2-L10a-Egfp TRAP hESC line to profile gene expression in differentiating hPSC-PCs, finding that the key gene expression pathways of differentiated hPSC-PCs most closely matched those of late juvenile, mouse PCs (P21). Comparative bioinformatics identified classical PC gene signatures as well as novel mitochondrial and autophagy gene pathways during the differentiation of both mouse and human PCs. In addition, we identified genes expressed in hPSC-PCs but not mouse PCs and confirmed protein expression of a novel human PC gene, CD40LG, expressed in both hPSC-PCs and native human cerebellar tissue. This study therefore provides the first direct comparison of hPSC-PC and mouse PC gene expression and a robust method for generating differentiated hPSC-PCs with human-specific gene expression for modeling developmental and degenerative cerebellar disorders.