ABSTRACT Malaria parasite genomes have been generated predominantly using short read sequencing technology which can be slow, requires advanced laboratory training and does not adequately interrogate complex genomic regions that harbour important malaria virulence determinants. The portable Oxford Nanopore Technologies MinION platform generates long reads in real time and may overcome these limitations. We present compelling evidence that Nanopore sequencing delivers valuable additional information for malaria parasites with comparable data fidelity for single nucleotide variant (SNV) calls, compared to standard Illumina whole genome sequencing. We demonstrate this through sequencing of pure Plasmodium falciparum DNA, mock infections and natural isolates. Nanopore has low error rates for haploid SNV genotyping and identifies structural variants (SVs) not detected with short reads. Nanopore genomes are directly comparable to publically available genomes and produce high quality end to end chromosome assemblies. Nanopore sequencing will expedite genomic surveillance of malaria and provide new insights into parasite genome biology.

Abstract With resistance to most antimalarials increasing, it is imperative that new drugs are developed. We previously identified an aryl acetamide compound, MMV006833 (M-833), that inhibited the ring-stage development of newly invaded merozoites. Here, we select parasites resistant to M-833 and identify mutations in the START lipid transfer protein (PF3D7_0104200, Pf START1). Introducing Pf START1 mutations into wildtype parasites reproduces resistance to M-833 as well as to more potent analogues. Pf START1 binding to the analogues is validated using organic solvent-based Proteome Integral Solubility Alteration (Solvent PISA) assays. Imaging of invading merozoites shows the inhibitors prevent the development of ring-stage parasites potentially by inhibiting the expansion of the encasing parasitophorous vacuole membrane. The Pf START1-targeting compounds also block transmission to mosquitoes and with multiple stages of the parasite’s lifecycle being affected, Pf START1 represents a drug target with a new mechanism of action.

Genetic studies of malaria parasites increasingly feature estimates of relatedness. However, various aspects of malaria parasite relatedness estimation are not fully understood. For example, estimates of relatedness based on whole-genome-sequence (WGS) data often exceed those based on more sparse data types. We explore systematic bias in relatedness estimation using theoretical, numerical and empirical approaches. Specifically, we use a non-ancestral model of pairwise relatedness to derive theoretical results; a simulation model of ancestry to independently verify and expand our theoretical results; and data on parasites sampled from Guyana to explore how theoretical and numerical results translate empirically. We show that allele frequencies encode, locus-by-locus, relatedness averaged over the set of sampled parasites used to compute them. These sample allele frequencies are typically plugged into the models used to estimate pairwise relatedness. Consequently, models of pairwise relatedness are misspecified and pairwise relatedness values are systematically underestimated. However, systematic underestimation can be viewed as population-relatedness calibration, i.e., a way of generating measures of relative relatedness. Systematic underestimation is unavoidable when relatedness is estimated assuming independence between genetic markers. It is mitigated when estimated using WGS data under a hidden Markov model (HMM), which exploits linkage between proximal markers. Estimates of absolute relatedness generated under a HMM using relatively sparse data should be treated with caution because the extent to which underestimation is mitigated is unknowable. That said, analyses dependent on absolute values and high relatedness thresholds are relatively robust. In summary, practitioners have two options: resolve to use relative relatedness estimated under independence or try to estimate absolute relatedness under a HMM. We propose various practical tools to help practitioners evaluate their situation on a case-by-case basis.

Abstract Large-scale comparative genomics- and population genetic studies generate enormous amounts of polymorphism data in the form of DNA variants. Ultimately, the goal of many of these studies is to associate genetic variants to phenotypes or fitness. We introduce VIVID, an interactive, user-friendly web application that integrates a wide range of approaches for encoding genotypic to phenotypic information in any organism or disease, from an individual or population, in three-dimensional (3D) space. It allows mutation mapping and annotation, calculation of interactions and conservation scores, prediction of harmful effects, analysis of diversity and selection, and 3-dimensional (3D) visualisation of genotypic information encoded in Variant Call Format (VCF) on AlphaFold2 protein models. VIVID enables the rapid assessment of genes of interest in the study of adaptive evolution and the genetic load, and it helps prioritising targets for experimental validation. We demonstrate the utility of VIVID by exploring the evolutionary genetics of the parasitic protist Plasmodium falciparum , revealing geographic variation in the signature of balancing selection in potential targets of functional antibodies.

Abstract With resistance to most antimalarials increasing, it is imperative that new antimalarial drugs are developed to replace or complement front-line artemisinin therapies. We previously identified an aryl acetamide compound, MMV006833 (M-833), that inhibited ring development of newly invaded merozoites. Here, we selected parasites resistant to M-833 and identified independent mutations arising in the START lipid transfer protein (PF3D7_0104200, PfSTART1). Introduction of the identified PfSTART1 mutations into wildtype parasites reproduced resistance to both M-833 and highly potent analogues, confirming PfSTART1 mutations were sufficient to confer resistance. The analogues bound to recombinant PfSTART1 with nanomolar affinity. We also demonstrated selective PfSTART1 engagement by the analogues using organic solvent-based Proteome Integral Solubility Alteration (Solvent PISA) assay for the first time in Plasmodium. Imaging of newly invaded merozoites showed the inhibitors prevented the conversion into larger amoeboid ring-stage parasites potentially through the inhibition of phospholipid transfer from the parasite to the encasing parasitophorous vacuole membrane (PVM) and/or within the parasite. We show that these PfSTART1 inhibitors also block transmission. With multiple stages of the parasite’s lifecycle being targeted by PfSTART1 inhibitors, this protein therefore represents a novel drug target with a new mechanism of action.

The rapid and aggressive spread of artemisinin-resistant Plasmodium falciparum carrying the kelch13 C580Y mutation is a growing threat to malaria elimination in Southeast Asia, but there is no evidence of their spread to other regions. We conducted cross-sectional surveys in 2016 and 2017 at two clinics in Wewak, Papua New Guinea (PNG) where we identified three infections caused by C580Y mutants among 239 genotyped clinical samples. One of these mutants exhibited the highest survival rate (6.8%) among all parasites surveyed in ring-stage survival assays (RSA) for artemisinin. Analyses of kelch13 flanking regions, and comparisons of deep sequencing data from 389 clinical samples from PNG, Indonesian Papua and Western Cambodia, suggested an independent origin of the Wewak C580Y mutation, showing that the mutants possess several distinctive genetic features. Identity by descent (IBD) showed that multiple portions of the mutants' genomes share a common origin with parasites found in Indonesian Papua, comprising several mutations within genes previously associated with drug resistance, such as mdr1, ferredoxin, atg18 and pnp. These findings suggest that a P. falciparum lineage spreading on the island of New Guinea has gradually acquired a complex ensemble of variants, including kelch13 C580Y, which may affect the parasites' drug sensitivity. This worrying development reinforces the need for increased surveillance of the evolving parasite populations on the island, to contain the spread of resistance.

ABSTRACT Plasmodium vivax is now the main cause of malaria outside Africa. The gametocytocidal effects of antimalarial drugs are important to reduce malaria transmissibility, particularly in low transmission settings, but they are not well characterized for P. vivax . The transmission-blocking effects of chloroquine, artesunate and methylene blue on P. vivax gametocytes were assessed. Blood specimens were collected from patients presenting with vivax malaria, incubated with or without the tested drugs, and then fed to mosquitos from a laboratory-adapted colony of Anopheles dirus (a major malaria vector in Southeast Asia). The effects on oocyst and sporozoite development were analyzed under a multi-level Bayesian model accounting for assay variability and the heterogeneity of mosquito Plasmodium -infection. Artesunate and methylene blue, but not chloroquine, exhibited potent transmission-blocking effects. Gametocyte exposures to artesunate and methylene blue reduced the mean oocyst count 469 fold (95%CI: 345 to 650) and 1438 fold (95%CI: 970 to 2064) respectively. The corresponding estimates for the sporozoite stage were a 148 fold reduction (95%CI: 61 to 470) and a 536 fold reduction (95%CI: 246 to 1311) in the mean count, respectively. In contrast, high chloroquine exposures reduced the mean oocyst count by only 1.40 fold (95%CI: 1.20 to 1.64) and the mean sporozoite count 1.34 fold (95%CI: 1.12 to 1.66). This suggests that patients with vivax malaria often remain infectious to anopheline mosquitos after treatment with chloroquine. Immediate initiation of primaquine radical cure or use of artemisinin combination therapies would reduce the transmissibility of P. vivax infections.

Abstract With emerging resistance to frontline treatments, it is vital that new antimalarial drugs are identified to target Plasmodium falciparum . We have recently described a compound, MMV020291, as a specific inhibitor of red blood cell invasion, and have generated analogues with improved potency. Here, we identify actin and profilin as putative targets of the MMV020291 series through resistance selection and whole genome sequencing of three MMV020291 resistant populations. This revealed three non-synonymous single nucleotide polymorphisms in two genes; two in profilin (N154Y, K124N) and a third one in actin-1 (M356L). Using CRISPR-Cas9, we engineered these mutations into wildtype parasites which rendered them resistant to MMV020291. We demonstrate that MMV020291 reduces actin polymerisation that is required by the merozoite stage parasites to invade red blood cells. Additionally, the series inhibits the actin-1 dependent process of apicoplast segregation, leading to a delayed death phenotype. In vitro co-sedimentation experiments using recombinant P. falciparum actin-1 and profilin proteins indicate that potent MMV020291 analogues amplify the actin-monomer sequestering effect of profilin, thereby reducing the formation of filamentous actin. Altogether, this study identifies the first compound series targeting the actin-1/profilin interaction in P. falciparum and paves the way for future antimalarial development against the highly dynamic process of actin polymerisation.