pneumonia (PjP) poses a serious risk to individuals with compromised immune systems, such as individuals with HIV/AIDS or undergoing immunosuppressive therapies for cancer or solid organ transplants. Severe PjP triggers excessive lung inflammation, resulting in lung function decline and consequential alveolar damage, potentially culminating in acute respiratory distress syndrome. Non-HIV patients face a 30-60%mortality rate, emphasizing the need for a deeper understanding of inflammatory responses in PjP. Prior research emphasized macrophages in

Abstract Pneumocystis spp. are host obligate fungal pathogens that can cause severe pneumonia in mammals and rely heavily on their host for essential nutrients. The lack of a sustainable in vitro culture system poses challenges in understanding their metabolism and the acquisition of essential nutrients from host lungs remains unexplored. Transmission electron micrographs show Extracellular Vesicles (EVs) are found near Pneumocystis spp. within the lung. We hypothesized that EVs transport essential nutrients to the fungi during infection. To investigate this, EVs from P. carinii and P. murina infected rodents were biochemically and functionally characterized. These EVs contained host proteins involved in cellular, metabolic, and immune processes as well as proteins with homologs found in other fungal EV proteomes, indicating Pneumocystis may release EVs. Notably, EV uptake by P. carinii indicated their potential involvement in nutrient acquisition and indicate a possibility for using engineered EVs for efficient therapeutic delivery. However, EVs added to P. carinii in vitro , did not show increased growth or viability, implying that additional nutrients or factors are necessary to support their metabolic requirements. Exposure of macrophages to EVs increased proinflammatory cytokine levels, but did not affect macrophages’ ability to kill or phagocytose P. carinii . These findings provide vital insights into P. carinii and host EV interactions, yet the mechanisms underlying P. carinii ’s survival in the lung remain uncertain. These studies are the first to isolate, characterize, and functionally assess EVs from Pneumocystis -infected rodents, promising to enhance our understanding of host-pathogen dynamics and therapeutic potential.

Many preclinical studies of infectious diseases have neglected experimental designs that evaluate potential differences related to sex with a concomitant over-reliance on male model systems. Hence, the NIH implemented a monitoring system for sex inclusion in preclinical studies. Methods: Per this mandate, we examined the lung burdens of Pneumocystis murina infection in 3 mouse strains in both male and female animals at early, mid and late time points. Results: Females in each strain had higher infection burdens compared to males at the later time points. Conclusion: Females should be included in experimental models studying Pneumocystis.

Pneumocystis , a major opportunistic pathogen in patients with a broad range of immunodeficiencies, contains abundant surface proteins encoded by a multi-copy gene family, termed the major surface glycoprotein (Msg) gene superfamily. This superfamily has been identified in all Pneumocystis species characterized to date, highlighting its important role in Pneumocystis biology. In this report, through a comprehensive and in-depth characterization of 459 msg genes from 7 Pneumocystis species, we demonstrate, for the first time, the phylogeny and evolution of conserved domains in Msg proteins, and provide detailed description of the classification, unique characteristics and phylogenetic relatedness of five Msg families. We further describe the relative expression levels of individual msg families in two rodent Pneumocystis species, the substantial variability of the msg repertoires in P. carinii from laboratory and wild rats, and the distinct features of the expression site for the classic msg genes in Pneumocystis from 8 mammalian host species. Our analysis suggests a wide variety of functions for this superfamily, not only conferring antigenic variation to allow immune evasion but also mediating life-stage development, optimizing cell mobility and adhesion, and adapting to specific host niches or environmental conditions. This study provides a rich source of information that lays the foundation for the continued experimental exploration of the functions of the Msg superfamily in Pneumocystis biology.

Abstract Pneumocystis jirovecii , the fungal agent of human Pneumocystis pneumonia, is closely related to macaque Pneumocystis . Little is known about other Pneumocystis species in distantly related mammals, none of which are capable of establishing infection in humans. The molecular basis of host specificity in Pneumocystis remains unknown as experiments are limited due to an inability to culture any species in vitro . To explore Pneumocystis evolutionary adaptations, we have sequenced the genomes of species infecting macaques, rabbits, dogs and rats and compared them to available genomes of species infecting humans, mice and rats. Complete whole genome sequence data enables analysis and robust phylogeny, identification of important genetic features of the host adaptation, and estimation of speciation timing relative to the rise of their mammalian hosts. Our data reveals novel insights into the evolution of P. jirovecii , the sole member of the genus able to infect humans.

Abstract Surface antigenic variation is crucial for major pathogens that infect humans, e.g. Plasmodium 1 , Trypanosoma 2 , Giardia 3 . In order to escape the immune system, they exploit various mechanisms in order to modify or exchange the protein that is exposed on the cell surface, at the genetic, expressional, and/or epigenetic level 4 . Understanding these mechanisms is important to better prevent and fight the deadly diseases caused. However, those used by the fungus Pneumocystis jirovecii that causes life-threatening pneumonia in immunocompromised individuals remain poorly understood. Here, though this fungus is currently not cultivable 5 , our detailed analysis of the subtelomeric sequence motifs and genes encoding surface proteins suggest that the system involves mediation of homologous recombinations during meiosis by DNA triplexes. This leads to the reassortment of the repertoire of ca. 80 non-expressed genes present in each strain, from which single genes are retrieved for mutually exclusive expression within subpopulations of cells 6 . The recombinations generates also constantly new mosaic genes. Dispersion of the new alleles and repertoires, supposedly by healthy carrier individuals, appears very efficient because identical alleles are observed in patients from all over the world. Our observations reveal a unique strategy of antigenic variation allowing colonization of the non-sterile niche corresponding to lungs of healthy humans. They also highlight the possible role in genome rearrangements of small imperfect mirror sequences forming DNA triplexes 7 . Such mirror sequences are widespread in eukaryotic genomes 8 , as well as in HIV virus 9 , but remain poorly understood so far.

Centromeres are genomic regions that coordinate accurate chromosomal segregation during mitosis and meiosis. Yet, despite their essential function, centromeres evolve rapidly across eukaryotes. Centromeres are often the sites of chromosomal breaks which contribute to genome shuffling and promote speciation by inhibiting gene flow. How centromeres form in strongly host-adapted fungal pathogens has yet to be investigated. Here, we characterized the centromere structures in closely related species of mammalian-specific pathogens of the fungal phylum of Ascomycota. Methods allowing reliable continuous culture of Pneumocystis species do not currently exist, precluding genetic manipulation. CENP-A, a variant of histone H3, is the epigenetic marker that defines centromeres in most eukaryotes. Using heterologous complementation, we show that the Pneumocystis CENP-A ortholog is functionally equivalent to CENP-ACnp1 of Schizosaccharomyces pombe. Using organisms from a short-term in vitro culture or infected animal models and ChIP-seq, we identified centromeres in three Pneumocystis species that diverged ~100 million years ago. Each species has a unique short regional centromere (< 10kb) flanked by heterochromatin in 16-17 monocentric chromosomes. They span active genes and lack conserved DNA sequence motifs and repeats. CENP-C, a scaffold protein that links the inner centromere to the kinetochore appears dispensable in one species, suggesting a kinetochore rewiring. Despite the loss of DNA methyltransferases, 5-methylcytosine DNA methylation occurs in these species, though not related to centromere function. These features suggest an epigenetic specification of centromere function.