Abstract Bulked segregant analysis implemented in MutMap and QTL-seq is a powerful and efficient method to identify agronomically important loci. However, the previous pipelines were not user-friendly to install and run. Here, we describe new pipelines for MutMap and QTL-seq. These updated pipelines are approximately 5-8 times faster than the previous pipeline, are easier for novice users to use and can be easily installed through bioconda with all dependencies.

Abstract In plants, many invading microbial pathogens are recognized by cell-surface pattern recognition receptors (PRRs), inducing defense responses; yet how PRRs perceive pathogen sphingolipids remains unclear. Here, we show that the ceramide Pi-Cer D from a plant pathogenic oomycete Phytophthora infestans triggers defense responses in Arabidopsis. Pi-Cer D is cleaved by an Arabidopsis apoplastic ceramidase, NCER2, and the resulting 9-methyl-branched sphingoid base is recognized by a plasma membrane lectin receptor-like kinase, RDA2. Importantly, 9-methyl-branched sphingoid base, which is unique to microbes, induces plant immune responses by interacting with RDA2. Loss of RDA2 or NCER2 function compromised Arabidopsis resistance against an oomycete pathogen, indicating that these are crucial for defense. We provide new insights that help elucidate the recognition mechanisms of pathogen-derived lipid molecules in plants. One Sentence Summary Oomycete-derived ceramide is cleaved into sphingoid base by ceramidase and recognized by an Arabidopsis receptor kinase.

Abstract Throughout their evolution, plant nucleotide-binding leucine-rich-repeat receptors (NLRs) have acquired widely divergent unconventional integrated domains that enhance their ability to detect pathogen effectors. However, the functional dynamics that drive the evolution of NLRs with integrated domains (NLR-IDs) remain poorly understood. Here, we reconstructed the evolutionary history of an NLR locus prone to unconventional domain integration and experimentally tested hypotheses about the evolution of NLR-IDs. We show that the rice ( Oryza sativa ) NLR Pias recognizes the effector AVR-Pias of the blast fungal pathogen Magnaporthe oryzae . Pias consists of a functionally specialized NLR pair, the helper Pias-1 and the sensor Pias-2, that is allelic to the previously characterized Pia pair of NLRs: the helper RGA4 and the sensor RGA5. Remarkably, Pias-2 carries a C-terminal DUF761 domain at a similar position to the heavy metal–associated (HMA) domain of RGA5. Phylogenomic analysis showed that Pias-2/RGA5 sensor NLRs have undergone recurrent genomic recombination within the genus Oryza , resulting in up to six sequence-divergent domain integrations. Allelic NLRs with divergent functions have been maintained trans-species in different Oryza lineages to detect sequence-divergent pathogen effectors. By contrast, Pias-1 has retained its NLR helper activity throughout evolution and is capable of functioning together with the divergent sensor-NLR RGA5 to responds to AVR-Pia. These results suggest that opposite selective forces have driven the evolution of paired NLRs: highly dynamic domain integration events maintained by balancing selection for sensor NLRs, in sharp contrast to purifying selection and functional conservation of immune signaling for helper NLRs. Significance statement Plants have evolved sophisticated defense mechanisms to fend off pathogens. Plant nucleotide-binding leucine-rich repeat receptor (NLR) proteins play crucial roles in detecting pathogen molecules inside plant cells and mounting defense responses. Here, we identified the Pias gene from rice, which encodes the NLR pair Pias-1 “helper” and Pias-2 “sensor.” These proteins function together to detect the pathogen molecule AVR-Pias of Magnaporthe oryzae and defend against rice blast disease. Pias is allelic to the previously reported Pia gene. A comparison of Pias/Pia alleles among Oryza species showed that Pias/Pia helper is evolutionarily and functionally conserved, whereas the Pias/Pia sensor shows highly dynamic evolution, with various host domains integrated into similar positions, allowing it to detect a wide variety of pathogen molecules.

Abstract White Guinea yam ( Dioscorea rotundata ) is an important staple tuber crop of West Africa. However, its origin remains unclear. In this study, we re-sequenced 336 accessions of white Guinea yam and compared them with the sequences of the wild Dioscorea species using an improved reference genome sequence of D. rotundata . Our results suggest a hybrid origin of white Guinea yam from crosses between the rainforest wild species D. praehensilis and the savannah-adapted D. abyssinica . We identified a higher genomic contribution from D. abyssinica in the sex chromosome of Guinea yam and an extensive introgression around the SWEETIE gene. Our findings point to a complex domestication scenario for Guinea yam and highlight the importance of wild species as gene donors for improvement of this crop through molecular breeding.

Abstract Dioscorea tokoro is a wild species distributed in East Asia including Japan. Typical of the genus Dioscorea, D. tokoro is dioecious with male and female flowers borne on separate individuals. To understand its sex determination system and to serve as a model species for population genomics of obligate outcrossing wild species, we set out to determine the whole genome sequence of the species. Here we show 443 Mb genome sequence of D. tokoro distributed over 2,931 contigs that were anchored on 10 linkage groups. Linkage analysis of sex in a segregating F1 family revealed a sex determination locus residing on Pseudochromosome 3 with XY-type male heterogametic sex determination system.

Abstract Studies focused solely on single organisms can fail to identify the networks underlying host–pathogen gene-for-gene interactions. Here, we integrate genetic analyses of rice ( Oryza sativa , host) and rice blast fungus ( Magnaporthe oryzae , pathogen) and uncover a new pathogen recognition specificity of the rice nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat protein (NLR) immune receptor Pik, which mediates resistance to M. oryzae expressing the avirulence effector gene AVR-Pik . Rice Piks-1, encoded by an allele of Pik-1 , recognizes a previously unidentified effector encoded by the M. oryzae avirulence gene AVR-Mgk1 , which is found on a mini-chromosome. AVR-Mgk1 has no sequence similarity to known AVR-Pik effectors, and is prone to deletion from the mini-chromosome mediated by repeated Inago2 retrotransposon sequences. AVR-Mgk1 is detected by Piks-1 and by other Pik-1 alleles known to recognize AVR-Pik effectors; recognition is mediated by AVR-Mgk1 binding to the integrated heavy metal-associated (HMA) domain of Piks-1 and other Pik-1 alleles. Our findings highlight how complex gene-for-gene interaction networks can be disentangled by applying forward genetics approaches simultaneously to the host and pathogen. We demonstrate dynamic co-evolution between an NLR integrated domain and multiple families of effector proteins.

Summary Studying epistatic gene interactions is important in understanding genetic architecture of complex traits in organisms. However, due to an enormous number of gene combinations to be analyzed, detection of epistatic gene-gene interactions has been computationally demanding. Here, we show a simple approach RIL-StEp, specialized to Recombinant Inbred Lines (RILs), to study epistasis using single nucleotide polymorphisms (SNPs) information of the genome. We applied the method to reveal epistasis affecting rice seed hull color phenotype, and successfully identified gene pairs that presumably control seed hull color. This method has a potential to enhancing our understanding of genetic architecture of various traits.

Abstract When infecting plants, fungal pathogens secrete cell wall degrading enzymes (CWDEs) that break down cellulose and hemicellulose, the primary components of plant cell walls. Some fungal CWDEs contain a unique domain, named the carbohydrate binding module (CBM), that facilitates their access to polysaccharides. However, little is known about how plants counteract pathogen degradation of their cell walls. Here, we show that the rice cysteine-rich repeat secretion protein OsCBMIP binds to and inhibits xylanase MoCel10A of the blast fungus pathogen Magnaporthe oryzae , interfering with its access to the rice cell wall and degradation of rice xylan. We found binding of OsCBMIP to various CBM1-containing enzymes, suggesting it has a general role in inhibiting the catalytic activities of fungal enzymes. OsCBMIP is localized to the apoplast, and its expression is strongly induced in leaves infected with M. oryzae . Remarkably, knockdown of OsCBMIP reduced rice defense against M. oryzae , demonstrating that inhibition of CBM1-containing fungal enzymes by OsCBMIP is crucial for rice defense. We also identified additional CBMIP-related proteins from Arabidopsis thaliana and Setaria italica , indicating that a wide range of plants counteract pathogens through this mechanism. Summary Plants have evolved various activity-inhibiting proteins as a defense against fungal cell wall degrading enzymes (CWDEs), but how plants counteract the function of fungal enzymes containing carbohydrate binding modules (CBMs) remains unknown. Here, we demonstrate that OsCBMIP, a member of the cysteine-rich repeat secretion protein family, interacts with fungal CBM1. OsCBMIP binding to CBM1 of a blast fungal xylanase blocks access to cellulose, resulting in the inhibition of xylanase enzymatic activity. Our study provides significant insights into plant countermeasure against CWDEs in the apoplastic space during plant–fungal pathogen interactions. It also reveals a molecular function of the DUF26 domain widely distributed in plant proteins.

Abstract Direct seeding is employed to circumvent the labor-intensive process of rice ( Oryza sativa ) transplantation, but this approach requires varieties with vigorous low-temperature germination (LTG) when sown in cold climates. To investigate the genetic basis of LTG, we identified the quantitative trait locus (QTL) qLTG11 from rice variety Arroz da Terra, which shows rapid seed germination at lower temperatures, using QTL-seq. We delineated the candidate region to a 52-kb interval containing GENERAL REGULATORY FACTOR14h ( GF14h ) gene, which is expressed during seed germination. The Arroz da Terra GF14h allele encodes functional GF14h, whereas Japanese rice variety Hitomebore harbors a 4-bp deletion in the coding region. Knocking out functional GF14h in a near-isogenic line (NIL) carrying the Arroz da Terra allele decreased LTG, whereas overexpressing functional GF14h in Hitomebore increased LTG, indicating that GF14h is the causal gene behind qLTG11 . Analysis of numerous Japanese rice accessions revealed that the functional GF14h allele was lost from popular varieties during modern breeding. We generated a NIL in the Hitomebore background carrying a 172-kb genomic fragment from Arroz da Terra including GF14h . The NIL showed superior LTG compared to Hitomebore, with otherwise comparable agronomic traits. The functional GF14h allele from Arroz da Terra represents a valuable resource for direct seeding in cold regions. Author Summary Rice serves as a fundamental crop sustaining over half of the global population. With the rapid growth of the world’s population, it will become increasingly important to improve rice productivity. On the other hand, the aging of rice farmers in Japan has resulted in a constant labor shortage. To address this, direct seeding, in which seeds are sown directly in rice fields without going through the most labor-intensive part of the rice cultivation process, i.e., seedling production and transplanting, has been recommended. However, prevalent elite rice varieties are known to be unsuitable for direct seeding due to their poor seed germination ability under low-temperature conditions. In this study, we show for the first time that GF14h gene from the Portuguese variety Arroz da Terra improves seed germination at low temperatures (LTG). In addition, a novel cross-bred line was generated by introducing the GF14h -containing genomic segment from Arroz da Terra into Hitomebore, a widely cultivated variety in northern Japan. This line is expected to be used as a pre-breeding material to enhance LTG. This study will provide a genetic basis for LTG and contribute to basic and applied research progress.

Nucleotide-binding, leucine-rich repeat receptors (NLRs) are conserved cytosolic receptors that recognize pathogen effectors and trigger immunity in plants. Recent studies indicate that NLRs function in pairs. Rice resistance gene Pii has been known to confer resistance against rice blast pathogen Magnaporthe oryzae carrying AVR-Pii. Previously we reported isolation of Pii gene from the rice cultivar Hitomebore (Takagi et al. 2013). To further understand rice components required for Pii-mediated resistance, we screened 5,600 mutant lines of Hitomebore cultivar and identified two mutants that lost Pii resistance without any changes in Pii gene sequence. Application of MutMap-Gap, the whole genome sequencing-based method of mutation identification, to the two mutants revealed that they have mutations in another NLR gene located close to Pii. The F1 plants derived from a cross of the two mutants showed pii phenotype, demonstrating that the newly identified NLR gene is indeed a component of Pii resistance. We thus designate the previously isolated Pii gene as Pii-1 and the newly isolated NLR gene as Pii-2.