ABSTRACT Salt-inducible kinases (SIKs) are key metabolic regulators. Imbalance of SIK function is associated with the development of diverse cancers, including breast, gastric and ovarian cancer. Chemical tools to clarify the roles of SIK in different diseases are, however, sparse and are generally characterized by poor kinome-wide selectivity. Here, we have adapted the pyrido[2,3- d ]pyrimidin-7-one-based PAK inhibitor G-5555 for the targeting of SIK, by exploiting differences in the back-pocket region of these kinases. Optimization was supported by high-resolution crystal structures of G-5555 bound to the known off-targets MST3 and MST4, leading to a chemical probe, MRIA9, with dual SIK/PAK activity and excellent selectivity over other kinases. Furthermore, we show that MRIA9 sensitizes ovarian cancer cells to treatment with the mitotic agent paclitaxel, confirming earlier data from genetic knockdown studies and suggesting a combination therapy with SIK inhibitors and paclitaxel for the treatment of paclitaxel-resistant ovarian cancer.

Mammalian STE20-like (MST) kinases 1-4 play key roles in regulating the Hippo and autophagy pathways, and their dysregulation has been implicated in cancer development. In contrast to the well-studied MST1/2, the roles of MST3/4 are less clear, in part due to the lack of potent and selective MST3/4 inhibitors. Here, we re-evaluated literature compounds, and used structure-guided design to optimize the p21-activated kinase (PAK) inhibitor G-5555 (8) to selectively target MST3/4. These efforts resulted in the development of MR24 (24) and MR30 (27) with good kinome-wide selectivity, high potency for MST3/4, and selectivity towards the closely related MST1/2. In combination with the MST1/2 inhibitor PF-06447475 (2) the two MST3/4 inhibitors can be used to elucidate the multiple roles of MST kinases in cells. We found that MST3/4-selective inhibition caused a cell cycle arrest in the G1 phase, while MST1/2 inhibition resulted in accumulation of cells in the G2/M phase. These data point to distinct functions of these closely related kinases, which can now be addressed with subfamily-selective chemical tool compounds.

The transforming growth factor beta-receptor I/activin receptor-like kinase 5 (TGFBR1/ALK5) and its close homologue ALK4 are receptor protein kinases associated with the development of diverse diseases, including cancer, fibrosis, heart diseases and dysfunctional immune response. Therefore, ALK4/5 are among the most studied kinases and several inhibitors have been developed. However, current commercially available inhibitors either lack selectivity or have not been comprehensively characterized, limiting their value for studying ALK4/5 function in cellular systems. To this end, we report the characterization of the 2-oxo-imidazopyridine, TP-008, a potent chemical probe with dual activity for ALK4 and ALK5 as well as the development of a matching negative control compound. TP-008 has excellent cellular potency and strongly abrogates phosphorylation of the substrate SMAD2 (mothers against decapentaplegic homolog 2). Thus, this chemical probe offers an excellent tool for mechanistic studies on the ALK4/5 signaling pathway and the contribution of these targets to disease.

Macrocyclization of acyclic compounds is a powerful strategy for improving inhibitor potency and selectivity. Here we have optimized 2-aminopyrimidine-based macrocycles to use these compounds as chemical tools for the ephrin kinase family. Starting with a promiscuous macrocyclic inhibitor,

Macrocyclization of acyclic compounds is a powerful strategy for improving inhibitor potency and selectivity. Here, we developed a 2-aminopyrimidine-based macrocyclic dual EPHA2/GAK kinase inhibitor as a chemical tool to study the role of these two kinases in viral entry and assembly. Starting with a promiscuous macrocyclic inhibitor,

MST1, MST2, MST3, MST4, and YSK1 are conserved members of the mammalian sterile 20 kinase (MST) family. MSTs regulate key cellular functions such as cell proliferation, cell migration, metabolic regulation, and cell polarity. The MST3 isozyme plays a role in regulation of cell growth, autophagy and apoptosis, and its dysregulation has been linked to the occurrence of high-grade tumors with poor survival prognosis. To date, there are no isoform-selective inhibitors available that could be used for validating the role of MST3 in tumorigenesis and to assess its potential as an anti-cancer target for drug development. To this end, we have designed a new series of 3-aminopyrazole-based macrocycles based on the structure of an acyclic promiscuous kinase inhibitor. By varying moieties targeting the solvent-exposed region and optimizing the linker, macrocycle JA310 (21c) was synthesized. JA310 exhibited high cellular potency for MST3 with an EC50 = 106 nM and excellent kinome-wide selectivity with significantly lower cellular activity on the closely related kinase MST4 (EC50 = 1.4 uM). The high-resolution crystal structure of the MST3-JA310 complex provided intriguing insights into the distinct binding mode of the macrocycle, which was associated with large-scale structural rearrangements, including concerted induced-fit movements of the glycine-rich loop, the alphaC helix, and the activation loop. In summary, the developed macrocyclic MST3 inhibitor, JA310, demonstrates the utility of macrocyclization for the design of highly selective inhibitors and presents a first chemical probe for MST3.

ABSTRACT Salt-inducible kinases 1-3 (SIK1-3) are key regulators of the LKB1-AMPK pathway and play an important role in cellular homeostasis. Dysregulation of any of the three isoforms has been associated with tumorigenesis in liver, breast, and ovarian cancers. We have recently developed the dual pan-SIK/group I p21-activated kinase (PAK) chemical probe MRIA9. However, inhibition of p21-activated kinases has been associated with cardiotoxicity in vivo , which complicates the use of MRIA9 as a tool compound. Here, we present a structure-based approach involving the back-pocket and gatekeeper residues, for narrowing the selectivity of pyrido[2,3-d]pyrimidin-7(8 H )-one-based inhibitors towards SIK kinases, eliminating PAK activity. Optimization was guided by high-resolution crystal structure analysis and computational methods, resulting in a pan-SIK inhibitor, MR22, which no longer exhibited activity on STE group kinases and displayed excellent selectivity in a representative kinase panel. MR22-dependent SIK inhibition led to centrosome dissociation and subsequent cell-cycle arrest in ovarian cancer cells, as observed with MRIA9, conclusively linking these phenotypic effects to SIK inhibition. Taken together, MR22 represents a valuable tool compound for studying SIK kinase function in cells.

ABSTRACT Bromodomain and extra-terminal motif (BET) proteins and histone deacetylases (HDACs) are prime targets in cancer therapy. Recent research has particularly focused on the development of dual BET/HDAC inhibitors for hard-to-treat tumors such as pancreatic cancer. Here, we have developed a new series of potent dual BET/HDAC inhibitors by choosing starting scaffolds that enabled us to optimally merge the two functionalities into a single compound. Systematic structure-guided modification of both warheads then led to optimized binders that were superior in potency to both parent compounds, with the best molecules of this series binding to both BRD4 bromodomains as well as HDAC1/2 with EC 50 values in the 100-nanomolar range in cellular NanoBRET target engagement assays. Importantly, this on-target activity also translated into promising efficacy in pancreatic cancer and NUT midline carcinoma cells. Our lead molecules effectively blocked histone H3 deacetylation in pancreatic cancer cells and upregulated the tumor suppressor HEXIM1 and proapoptotic p57 , both markers of BET inhibition. In addition, they have the potential to downregulate oncogenic drivers of NUT midline carcinoma, as demonstrated for MYC and TP63 mRNA levels. Overall, this study expands the portfolio of available dual BET/class I HDAC inhibitors for future translational studies in different cancer models.

Abstract Histone H3K4 methylation serves as post-translational hallmark of actively transcribed genes and is introduced by histone methyltransferases (HMT) and its regulatory scaffolding proteins. One of these is the WD-repeat containing protein 5 (WDR5) that has also been associated with controlling long non-coding RNAs and transcription factors including MYC. The wide influence of dysfunctional HMTs complexes and the typically upregulated MYC levels in diverse tumor types suggested WDR5 as an attractive drug target. Indeed, protein-protein interface inhibitors for two protein interaction interfaces on WDR5 have been developed. While such compounds only inhibit a subset of WDR5 interactions, chemically induced proteasomal degradation of WDR5 might represent an elegant way to target all oncogenic function. This study presents the design, synthesis and evaluation of two diverse WDR5 degrader series based on two WIN site binding scaffolds and shows that linker nature and length strongly influence degradation efficacy.