Most of the human genome has now been sequenced and about 30,000 potential open reading frames have been identified, indicating that we use these 30,000 genes to functionally organize our biologic activities. However, functions of many genes are still unknown despite intensive efforts using bioinformatics as well as transgenic and knockout mice. Retrovirus-mediated gene transfer is a powerful tool that can be used to understand gene functions. We have developed a variety of retrovirus vectors and efficient packaging cell lines that have facilitated the development of efficient functional expression cloning methods. In this review, we describe retrovirus-mediated strategies used for investigation of gene functions and function-based screening strategies.

Most of the human genome has now been sequenced and about 30,000 potential open reading frames have been identified, indicating that we use these 30,000 genes to functionally organize our biologic activities. However, functions of many genes are still unknown despite intensive efforts using bioinformatics as well as transgenic and knockout mice. Retrovirus-mediated gene transfer is a powerful tool that can be used to understand gene functions. We have developed a variety of retrovirus vectors and efficient packaging cell lines that have facilitated the development of efficient functional expression cloning methods. In this review, we describe retrovirus-mediated strategies used for investigation of gene functions and function-based screening strategies.

Abstract Background Recently in Japan, six workers at a chemical plant that manufactures resins developed interstitial lung diseases after being involved in loading and packing cross-linked water-soluble acrylic acid polymers (CWAAPs). Since CWAAPs are not on the list of occupational diseases, the present study examined the lung damage potential of two CWAAPs (CWAAP-A and CWAAP-B) in rats, investigated pathological mechanisms, and established a method to rapidly evaluate the harmfulness of CWAAPs. Methods Using a whole-body inhalation exposure system, male F344 rats were exposed once to 40 or 100 mg/m 3 of CWAAP-A for 4 hours or to 15 or 40 mg/m 3 of CWAAP-A for 4 hours per day once per week for 2 months (a total of 9 exposures). In a separate set of experiments, male F344 rats were administered 1 mg/kg CWAAP-A or CWAAP-B by intratracheal instillation once every two weeks for 2 months (a total of five doses). Lung tissues, mediastinal lymph nodes, and bronchoalveolar lavage fluid were collected and subjected to biological and histopathological analyses. Results A single 4-hour exposure to CWAAP caused alveolar injury, and repeated exposures resulted in regenerative changes in the alveolar epithelium with activation of TGFβ signaling. During the recovery period after the last exposure, some alveolar lesions were partially healed, but other lesions developed into alveolitis with fibrous thickening of the alveolar septum. Rats administered CWAAP-A by intratracheal instillation developed qualitatively similar pulmonary pathology as rats exposed to CWAAP-A by inhalation. At 2 weeks after intratracheal instillation, rats administered CWAAP-B appeared to have a slightly higher degree of lung lesions compared to rats administered CWAAP-A, however, there was no difference in these lesions of CWAAP-A and CWAAP-B in rats examined 18 weeks after administration of these materials. Conclusions The present study provides evidence of rat lung pathogenesis after inhalation exposure to CWAAP-A. This study also demonstrates that the lung pathology of rats exposed to CWAAP-A by systemic inhalation was qualitatively similar to that of rats administered CWAAP-A by intratracheal instillation. The use of intratracheal instillation as an adjunct to systemic inhalation is expected to significantly accelerate the risk assessment for a variety of CWAAPs.

Abstract Targeting regulatory T cell (Treg) infiltration is an emerging strategy for cancer immunotherapy. However, the efficacy of this strategy in advanced prostate cancer remains unclear. Here, we describe the therapeutic efficacy of this strategy in a canine model of advanced prostate cancer. We used dogs with naturally occurring prostate cancer to study the molecular mechanism underlying Treg infiltration into tumor tissues and the effect of anti-Treg treatment. We found that tumor-infiltrating Tregs were associated with poor prognosis in dogs bearing spontaneous prostate cancer. RNA sequencing and protein analyses showed that Treg infiltration was mediated by interaction between the tumor-producing chemokine, CCL17, and the receptor CCR4 expressed on Tregs. Dogs with advanced prostate cancer responded to mogamulizumab, a monoclonal antibody targeting CCR4, with improved survival and low incidence of clinically relevant adverse events. Exploratory analyses showed urinary CCL17 concentration and BRAF V595E mutation to be independently predictive of the response to mogamulizumab. Analysis of a publicly available transcriptomic dataset of human prostate cancer showed that the CCL17/CCR4 axis correlated with the Treg marker, Foxp3. In silico survival analyses showed that high expression of CCL17 was associated with poor prognosis. Immunohistochemistry confirmed that tumor-infiltrating Tregs expressed CCR4 in human patients with prostate cancer. These findings suggest that anti-Treg treatment through the blocking of CCR4 is a promising therapeutic approach for advanced prostate cancer. One Sentence Summary Targeting regulatory T cell infiltration by CCR4 blockade induces objective responses and improves survival in a canine model of prostate cancer.

L-Asparaginase (L-Asp) is often used to induce remission in feline large-cell gastrointestinal lymphoma (LCGIL). However, no study has evaluated the efficacy and adverse events following the initial use of this drug as a first-line treatment in feline LCGIL. We retrospectively reviewed medical records of cats with LCGIL treated with L-Asp to induce remission. This study included 43 cats. The response rate (RR) after the first administration of L-Asp was 37.2% (Complete remission: 7.0 %, partial remission: 30.2%). RR was significantly higher in cases with primary gastric lesions (64.3%) than in those with primary intestinal lesions (24.1%) (P=0.018), and it was also higher in cases without anemia (57.1%) than those with anemia (15.0%) (P=0.009). The most common adverse event was hyperammonemia, which occurred in 10 of 12 cases where we could compare plasma ammonia concentrations before and after the first dose of L-Asp. Plasma phosphate concentrations were also significantly increased (P<0.001) within 24 hr after the first dose. Decreased appetite, vomiting, and diarrhea were also observed in five, three, and seven cases, respectively, and Grade 3 or higher gastrointestinal signs were observed as adverse events in three cases. The median overall survival of all cats was 150 days (range, 5–1,065 days), and the median progression-free survival was 104 days (range, 2–978 days). In conclusion, L-Asp was effective to induce remission, and severe adverse events were uncommon in feline LCGIL.

A 12-year-old spayed female Dalmatian presented with acute vomiting and anorexia. The clinicopathological and imaging abnormalities included icterus, biliary obstruction, and multiple diffuse splenic hypoechogenic nodules. Cholecystectomy was performed to remove the obstruction, followed by liver biopsy and splenectomy. Histopathological and immunohistology evaluation of the spleen, liver, and gallbladder revealed splenic marginal zone lymphoma (MZL) with gallbladder and hepatic infiltration of neoplastic CD20/CD79α-positive cells. Moreover, we observed clonal rearrangements of the immunoglobulin heavy-chain (IgH) gene in all three tissues. The dog was in good condition without chemotherapy. However, there was progressive elevation of liver enzymes, which could be attributed to neoplastic hepatic infiltration. Chlorambucil and prednisolone were administered until day 108, when the liver enzyme levels normalized. On day 156, the dog developed diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) of the peripheral lymph nodes. Sequence analysis of the clonally rearranged IgH gene revealed that all neoplastic cells in the spleen, gallbladder, and liver at initial presentation, as well as lymph nodes on day 156, possessed the same sequence identity of the amplified IgH fragments. This demonstrated that all neoplastic cells were derived from the same B-lymphocyte clone. The DLBCL was considered to have transformed from the splenic MZL, with gallbladder involvement. In cases of splenic MZL, it is important to consider gallbladder involvement and transformation to DLBCL. Moreover, gallbladder lymphoma should be included in the differential diagnosis of dogs with gallbladder abnormalities. Further studies are warranted to investigate the prognosis of splenic MZL.

Non-neoplastic bone marrow disorders are main causes of non-regenerative anemia in dogs. Despite the high incidence of the diseases, their molecular pathophysiology has not been elucidated. We previously reported that Miniature Dachshund (MD) was a predisposed breed to be diagnosed with non-neoplastic bone marrow disorders in Japan, and immunosuppressive treatment-resistant MDs showed higher number of platelets and morphological abnormalities in peripheral blood cells. These data implied that treatment-resistant MDs might possess distinct pathophysiological features from treatment-responsive MDs. Therefore, we conducted transcriptomic analysis of bone marrow specimens to investigate the pathophysiology of treatment-resistant MDs. Transcriptomic analysis comparing treatment-resistant MDs and healthy control dogs identified 179 differentially expressed genes (DEGs). Pathway analysis using these DEGs showed that "Wnt signaling pathway" was a significantly enriched pathway. We further examined the expression levels of DEGs associated with Wnt signaling pathway and confirmed the upregulation of AXIN2 and CCND2 and the downregulation of SFRP2 in treatment-resistant MDs compared with treatment-responsive MDs and healthy control dogs. This alteration implied the activation of Wnt signaling pathway in treatment-resistant MDs. The activation of Wnt signaling pathway has been reported in human patients with myelodysplastic syndrome (MDS), which is characterized by dysplastic features of blood cells. Therefore, the results of this study implied that treatment-resistant MDs have distinct molecular pathological features from treatment-responsive MDs and the pathophysiology of treatment-resistant MDs might be similar to that of human MDS patients.

IFNγ can initiate immune responses by inducing the expression of major histocompatibility complex molecules, suggesting its potential for cancer immunotherapy. However, it also has an immunosuppressive function that limits its application as a therapeutic agent. IFNγ has a characteristic domain-swapped dimer structure with two of the six α-helices exchanged with each other. As we hypothesized that the contrasting functions of IFNγ could be attributed to its unique domain-swapped structure, we designed monomeric IFNγ by transforming the domain-swapped dimer structure of wild-type IFNγ. We conjectured the evolution of this domain-swapped dimer and hypothesized that the current IFNγ structure emerged through shortening of the loop structure at the base of the swapped domain and the accumulation of hydrophobic amino acids at the newly generated interface during domain-swapping. We then designed and generated a stable monomeric IFNγ by retracing this evolutionary process, complementing the lost loop structure with a linker and replacing the accumulated hydrophobic amino acids with hydrophilic ones. We determined that the designed variant was a monomer based on molecular size and number of epitopes and exhibited activity in cell-based assays. Notably, the monomeric IFNγ showed a qualitatively similar balance between immunostimulatory and immunosuppressive gene expression as wild-type IFNγ. This study demonstrates that the structural format of IFNγ affects the strength of its activity rather than regulating the fate of downstream gene expression.

Helicobacter species infecting the stomachs of dogs and cats are potentially pathogenic and have been isolated from patients with gastric diseases. In the present study conducted in Japan, among the nine Helicobacter strains that we isolated from dogs and cats, NHP19-003 T from a dog, and strains NHP19-012 T and NHP21-005 T from cats were identified to be the strains most closely related to Helicobacter heilmannii ASB1 T based on a 16S rRNA comparison (98.7–99.2% similarity with H. heilmannii ASB1 T ). However, none of their whole genomes showed more than average nucleotide identity (ANI) threshold value (95–96%) to any Helicobacter species (85.1, 86.7, and 86.6% ANI, respectively, with H. heilmannii ASB1 T ), including when compared to each other. Furthermore, NHP19-003 T , NHP19-012 T , and NHP21-005 T exhibited protein profiles different from known gastric Helicobacter species, as revealed by MALDI-TOF MS, indicating that they are novel Helicobacter species. We, thus, propose these novel Helicobacter species as follows: Helicobacter gastrocanis sp. nov. (type strain NHP19-003 T [=JCM 39159 T = DSM 111619 T ]), Helicobacter gastrofelis sp. nov. (type strain NHP19-012 T [=JCM 39160 T ]) and Helicobacter felistomachi sp. nov. (type strain NHP21-005 T [=JCM 39513 T ]). These novel strains have respective GC content values of 48.3, 46.9, and 47.1%. Phylogenetic analysis based on ureAB gene sequences obtained from gastric specimens from 47 dogs and 24 cats in Japan revealed that 29.8% of dogs were infected with H. gastrocanis , while H. gastrofelis infected 44.7% of dogs and 12.5% of cats. Additionally, 10.6% of dogs and 20.8% of cats were infected with H. felistomachi . Animal experiments have confirmed that these three novel species elicit gastric inflammatory responses. This study findings reveal the prevalence of novel gastric Helicobacter species in dogs and cats in Japan and their pathogenicity.