SUMMARY Extremely preterm born individuals at < 28 postconceptional weeks (PCW) are at high risk for encephalopathy of prematurity and life-long neuropsychiatric conditions. Clinical studies and animal models of preterm brain injury suggest that encephalopathy of prematurity is strongly associated with exposure to hypoxia and/or inflammation in the perinatal period. Histologic examination of postmortem brain tissue from children born preterm demonstrates decreased numbers of cortical GABAergic interneurons in the cerebral cortex. However, the cellular and molecular mechanisms underlying the decreased numbers of GABAergic interneurons in the cerebral cortex of extremely preterm individuals remain unclear. Here, we developed a dual, complementary human cellular model to study hypoxia-induced interneuronopathies using human forebrain assembloids (hFA) derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and ex vivo human prenatal cerebral cortex at mid-gestation. The hFA are generated through the integration of region-specific neural organoids containing either dorsal forebrain (excitatory) glutamatergic neurons or ventral forebrain (inhibitory) GABAergic interneurons. We discover a substantial reduction in migration of cortical interneurons during exposure to hypoxic stress in both hFA and ex vivo human prenatal cerebral cortex. Next, we identify that this migration defect is restored by supplementation of hypoxic cell culture media with exogenous adrenomedullin (ADM), a peptide hormone member of the calcitonin gene related peptide (CGRP) family. Lastly, we demonstrate that the rescue is mediated through increased activity of the PKA molecular pathway and increased pCREB-dependent expression of GABA receptors. Overall, these findings provide important insights into the cellular mechanisms contributing to cortical interneuron depletion in preterm infants, and pinpoint novel therapeutic molecular pathways with high translational potential for hypoxic encephalopathy of prematurity.

ABSTRACT Astrocytes are emerging as key regulators of neuronal synaptic network maturation and function, through control of synaptic pruning. This is important, because individuals with ASD have excess glutamatergic synapses in the cortex, but the biological mechanisms underlying this phenotype remain unclear. Here, we used human cortical organoids (hCO) derived from induced pluripotent stem cells (hiPSCs), to examine the effect of hypoxia on synapse engulfment in human astrocytes at postnatal-equivalent stages of development. We identified that hypoxia significantly inhibits the synaptosome phagocytosis, and that this phenotype is mediated through disruptions in the astrocytic circadian rhythm molecular pathway and subsequent decreased expression of MEGF10. Lastly, we demonstrated that circadian clock disruptions are sufficient to induce these observed phenotypes even in the absence of hypoxia, both in hCOs and within the mouse hippocampus in vivo . Our study uncovers a novel mechanistic link between hypoxia, circadian rhythms disruptions, and synapse pruning by astrocytes, and provides insight into the pathophysiology of ASD, and other neuropsychiatric diseases. Separately, the demonstration of the presence of circadian rhythms in hCOs opens an unprecedented opportunity to dissect the role of circadian clocks in normal brain development and how it contributes to specific diseases of environmental or genetic origin.