A range of severe human diseases called ciliopathies are caused by the dysfunction of primary cilia. Primary cilia are cytoplasmic protrusions consisting of the basal body (BB), the axoneme and the transition zone (TZ). The BB is a modified mother centriole from which the axoneme, the microtubule-based ciliary scaffold, is formed. At the proximal end of the axoneme, the TZ functions as the ciliary gate governing ciliary protein entry and exit. Since ciliopathies often develop due to mutations in genes encoding proteins that localise to the TZ, the understanding of the mechanisms underlying TZ function is of eminent importance. Here, we show that the ciliopathy protein Rpgrip1l governs ciliary gating by ensuring the proper amount of Cep290 at the vertebrate TZ. Further, we identified the flavonoid eupatilin as a potential agent to tackle ciliopathies caused by mutations in RPGRIP1L as it rescues ciliary gating in the absence of Rpgrip1l.

Ciliogenesis is a general process in eukaryotic cells and its different steps begin to be well characterised. However, the molecular mechanisms leading to decilation or ciliary shedding are still poorly understood. This process, observed from unicellular organisms such as Chlamydomonas or Paramecium to multiciliated cells from trachea or fallopian tube of vertebrates, seems to be a general process since recent observations demonstrates its requirement during the cell cycle or neurogenesis. Interestingly, in all cellular models, ciliary shedding occurs distal to the transition zone, essentially known to act as a diffusion barrier between the intracellular space and the cilium, suggesting conserved molecular mechanisms. To determine if MKS and NPHP modules, known to cooperate to establish transition zone formation and function, could control ciliary shedding, we studied in Paramecium the function of TMEM216/MKS2 and TMEM107 (two members of the MKS module), NPHP4 (one member of the NPHP module), CEP290/NPHP6 and RPGRIP1L/MKS5. We show that all these proteins are recruited to the TZ as soon as growing cilia are detected and localise with a 9-fold symmetry at the level of the axonemal plate. Interestingly, we demonstrate that the depletion of the two MKS module proteins induces spontaneous cilia shedding, while the depletion of either NPHP4, CEP290 or RPGRIP1L inhibits the process. Our results constitute the first evidence for a role of conserved TZ proteins in deciliation and open new directions for understanding motile cilia physiology.

Cilia-driven movements of the cerebrospinal fluid (CSF) are involved in zebrafish axis straightness, both in embryos and juveniles [1, 2]. In embryos, axis straightness requires ciliadependent assembly of the Reissner fiber (RF), a SCO-spondin polymer running down the brain and spinal cord CSF-filled cavities [3]. Reduced expression levels of the urp1 and urp2 genes encoding neuropeptides of the Urotensin II family in CSF-contacting neurons (CSF-cNs) also underlie embryonic ventral curvature of several cilia motility mutants [4]. Moreover, mutants for scospondin and uts2r3 (a Urotensin II peptide family receptor gene) develop scoliosis at juvenile stages [3, 4]. However, whether RF maintenance and URP signaling are perturbed in juvenile scoliotic ciliary mutants and how these perturbations are linked to scoliosis is unknown. Here we produced mutants in the zebrafish ortholog of the human RPGRIP1L ciliopathy gene encoding a transition zone protein [5-7]. rpgrip1l-/- zebrafish had normal embryogenesis and developed 3D spine torsions in juveniles. Cilia lining the CNS cavities were normal in rpgrip1l-/- embryos but sparse and malformed in juveniles and adults. Hindbrain ventricle dilations were present at scoliosis onset, suggesting defects in CSF flow. Immunostaining showed a secondary loss of RF correlating with juvenile scoliosis. Surprisingly, transcriptome analysis of rgprip1l mutants at scoliosis onset uncovered increased levels of urp1 and urp2 expression. Overexpressing urp2 in foxj1-expressing cells triggered scoliosis in rpgrip1l heterozygotes. Thus, our results demonstrate that increased URP signaling drives scoliosis onset in a ciliopathy mutant. We propose that imbalanced levels of URP neuropeptides in CSF-cNs may be an initial trigger of scoliosis.

ABSTRACT Cilia defects lead to scoliosis in zebrafish, but the underlying pathogenic mechanisms are poorly understood and may diverge depending on the mutated gene. We dissected the mechanisms of scoliosis onset in a zebrafish mutant for the rpgrip1l gene encoding a ciliary transition zone protein. rpgrip1l mutant fish developed scoliosis with near-total penetrance but asynchronous onset in juveniles. Taking advantage of this asynchrony, we found that curvature onset was preceded by brain ventricle dilations and concomitant to the perturbation of Reissner fiber polymerization and to the loss of multicilia tufts around the subcommissural organ. Rescue experiments showed that Rpgrip1l was exclusively required in foxj1a -expressing cells to prevent axis curvature. Transcriptomic and proteomic studies identified neuroinflammation associated with increased Annexin levels as a potential mechanism of scoliosis development in rpgrip1l juveniles. Investigating the cell types associated with annexin2 over-expression, we uncovered astrogliosis, arising in glial cells surrounding the diencephalic and rhombencephalic ventricles just before scoliosis onset and increasing with time in severity. Anti-inflammatory drug treatment reduced scoliosis penetrance and severity and this correlated with both reduced astrogliosis and macrophage/microglia enrichment around the diencephalic ventricle. Mutation of the cep290 gene encoding another transition zone protein also associated astrogliosis with scoliosis. Thus, we propose that the onset of a feed-forward loop between astrogliosis, induced by perturbed ventricular homeostasis, and immune cells recruitment as a novel pathogenic mechanism of zebrafish scoliosis in ciliary transition zone mutants.

Body axis specification is a crucial event in animal embryogenesis, and was an essential evolutionary innovation for founding the animal kingdom. It involves two distinct components that coordinate to establish the spatial organisation of the embryo: initiation of cascades of regionalised gene expression and orientation of morphogenetic processes such as body elongation. Intense interest in the first component has revealed Wnt/β-catenin signalling as ancestrally responsible for initiating regional gene expression, but the evolutionary origin of oriented morphogenesis has received little attention. Here, by addressing the cell and morphological basis of body axis development in embryos of the cnidarian Clytia hemisphaerica, we have uncovered a simple and likely ancestral coordination mechanism between Wnt/β-catenin signalling and directed morphogenesis. We show that the ligand Wnt3, known to initiate oral gene expression via localised Wnt/β-catenin pathway activation, also has a key β-catenin-independent role in globally orienting planar cell polarity (PCP) to direct morphogenesis along the oral-aboral axis. This PCP orientation occurs in two distinct steps: local orientation by Wnt3 and global propagation by conserved core PCP protein interactions along the body axis. From these findings we propose novel scenarios for PCP-driven symmetry-breaking underlying the emergence of the animal body plan.

To produce a directional flow, ciliated epithelia display a uniform orientation of ciliary beating. Oriented beating requires planar cell polarity (PCP), which leads to planar orientation and asymmetric positioning of the ciliary basal body (BB) along the polarity axis. We took advantage of the polarized mono-ciliated epithelium of the embryonic zebrafish floor plate (FP) to investigate by live-imaging the dynamics and mechanisms of BB polarization. We showed that BBs, although bearing a cilium, were highly motile along the polarity axis, contacting either the anterior or posterior membranes, exclusively at the level of apical junctions positive for Par3. Par3 was posteriorly enriched before BB posterior positioning and FP polarization was disrupted upon Par3 overexpression. In the PCP mutant Vangl2, BBs showed poorly oriented movements correlated with Par3 mislocalization. Our data lead us to propose a conserved function for Par3 in controlling BB asymmetric positioning downstream of the PCP pathway.