Abstract Motivation: PSORTb has remained the most precise bacterial protein subcellular localization (SCL) predictor since it was first made available in 2003. However, the recall needs to be improved and no accurate SCL predictors yet make predictions for archaea, nor differentiate important localization subcategories, such as proteins targeted to a host cell or bacterial hyperstructures/organelles. Such improvements should preferably be encompassed in a freely available web-based predictor that can also be used as a standalone program. Results: We developed PSORTb version 3.0 with improved recall, higher proteome-scale prediction coverage, and new refined localization subcategories. It is the first SCL predictor specifically geared for all prokaryotes, including archaea and bacteria with atypical membrane/cell wall topologies. It features an improved standalone program, with a new batch results delivery system complementing its web interface. We evaluated the most accurate SCL predictors using 5-fold cross validation plus we performed an independent proteomics analysis, showing that PSORTb 3.0 is the most accurate but can benefit from being complemented by Proteome Analyst predictions. Availability: http://www.psort.org/psortb (download open source software or use the web interface). Contact: psort-mail@sfu.ca Supplementary Information: Supplementary data are availableat Bioinformatics online.

Membrane lipids were once thought to be homogenously distributed in the 2D surface of a membrane, but the lipid raft theory suggests that cholesterol and sphingolipids partition away from other membrane lipids. Lipid raft theory further implicates these cholesterol-rich domains in many processes such as signaling and vesicle traffic. However, direct characterization of rafts has been difficult, because they cannot be isolated in pure form. In the first functional proteomic analysis of rafts, we use quantitative high-resolution MS to specifically detect proteins depleted from rafts by cholesterol-disrupting drugs, resulting in a set of 241 authentic lipid raft components. We detect a large proportion of signaling molecules, highly enriched versus total membranes and detergent-resistant fractions, which thus far biochemically defined rafts. Our results provide the first large-scale and unbiased evidence, to our knowledge, for the connection of rafts with signaling and place limits on the fraction of plasma membrane composed by rafts.

Protein localization to membrane-enclosed organelles is a central feature of cellular organization. Using protein correlation profiling, we have mapped 1,404 proteins to ten subcellular locations in mouse liver, and these correspond with enzymatic assays, marker protein profiles, and confocal microscopy. These localizations allowed assessment of the specificity in published organellar proteomic inventories and demonstrate multiple locations for 39% of all organellar proteins. Integration of proteomic and genomic data enabled us to identify networks of coexpressed genes, cis-regulatory motifs, and putative transcriptional regulators involved in organelle biogenesis. Our analysis ties biochemistry, cell biology, and genomics into a common framework for organelle analysis.

Specialized secretion systems are used by numerous bacterial pathogens to export virulence factors into host target cells. Leishmania and other eukaryotic intracellular pathogens also deliver effector proteins into host cells; however, the mechanisms involved have remained elusive. In this report, we identify exosome-based secretion as a general mechanism for protein secretion by Leishmania, and show that exosomes are involved in the delivery of proteins into host target cells. Comparative quantitative proteomics unambiguously identified 329 proteins in Leishmania exosomes, accounting for >52% of global protein secretion from these organisms. Our findings demonstrate that infection-like stressors (37°C ± pH 5.5) upregulated exosome release more than twofold and also modified exosome protein composition. Leishmania exosomes and exosomal proteins were detected in the cytosolic compartment of infected macrophages and incubation of macrophages with exosomes selectively induced secretion of IL-8, but not TNF-α. We thus provide evidence for an apparently broad-based mechanism of protein export by Leishmania. Moreover, we describe a mechanism for the direct delivery of Leishmania molecules into macrophages. These findings suggest that, like mammalian exosomes, Leishmania exosomes function in long-range communication and immune modulation.

The first generation of genome sequence assemblies and annotations have had a significant impact upon our understanding of the biology of the sequenced species, the phylogenetic relationships among species, the study of populations within and across species, and have informed the biology of humans. As only a few Metazoan genomes are approaching finished quality (human, mouse, fly and worm), there is room for improvement of most genome assemblies. The honey bee (Apis mellifera) genome, published in 2006, was noted for its bimodal GC content distribution that affected the quality of the assembly in some regions and for fewer genes in the initial gene set (OGSv1.0) compared to what would be expected based on other sequenced insect genomes. Here, we report an improved honey bee genome assembly (Amel_4.5) with a new gene annotation set (OGSv3.2), and show that the honey bee genome contains a number of genes similar to that of other insect genomes, contrary to what was suggested in OGSv1.0. The new genome assembly is more contiguous and complete and the new gene set includes ~5000 more protein-coding genes, 50% more than previously reported. About 1/6 of the additional genes were due to improvements to the assembly, and the remaining were inferred based on new RNAseq and protein data. Lessons learned from this genome upgrade have important implications for future genome sequencing projects. Furthermore, the improvements significantly enhance genomic resources for the honey bee, a key model for social behavior and essential to global ecology through pollination.

Interactomes are often measured using affinity purification-mass spectrometry (AP-MS) or yeast two-hybrid approaches, but these methods do not provide stoichiometric or temporal information. We combine quantitative proteomics and size-exclusion chromatography to map 291 coeluting complexes. This method allows mapping of an interactome to the same depth and accuracy as AP-MS with less work and without overexpression or tagging. The use of triplex labeling enables monitoring of interactome rearrangements.

We investigated the properties of leishmania exosomes with respect to influencing innate and adaptive immune responses. Exosomes from Leishmania donovani modulated human monocyte cytokine responses to IFN-γ in a bimodal fashion by promoting IL-10 production and inhibiting that of TNF-α. Moreover, these vesicles were inhibitory with respect to cytokine responses (IL-12p70, TNF-α, and IL-10) by human monocyte-derived dendritic cells. Exosomes from wild-type (WT) L. donovani failed to prime monocyte-derived dendritic cells to drive the differentiation of naive CD4 T cells into IFN-γ-producing Th1 cells. In contrast, vesicles from heat shock protein (HSP)100(-/-) L. donovani showed a gain-of-function and proinflammatory phenotype and promoted the differentiation of naive CD4 lymphocytes into Th1 cells. Proteomic analysis showed that exosomes from WT and HSP100(-/-) leishmania had distinct protein cargo, suggesting that packaging of proteins into exosomes is dependent in part on HSP100. Treatment of C57BL/6 mice with WT L. donovani exosomes prior to challenge with WT organisms exacerbated infection and promoted IL-10 production in the spleen. In contrast, HSP100(-/-) exosomes promoted spleen cell production of IFN-γ and did not adversely affect hepatic parasite burdens. Furthermore, the proparasitic properties of WT exosomes were not species specific because BALB/c mice exposed to Leishmania major exosomes showed increased Th2 polarization and exacerbation of disease in response to infection with L. major. These findings demonstrate that leishmania exosomes are predominantly immunosuppressive. Moreover, to our knowledge, this is the first evidence to suggest that changes in the protein cargo of exosomes may influence the impact of these vesicles on myeloid cell function.

Abstract Background Leishmania and other intracellular pathogens have evolved strategies that support invasion and persistence within host target cells. In some cases the underlying mechanisms involve the export of virulence factors into the host cell cytosol. Previous work from our laboratory identified one such candidate leishmania effector, namely elongation factor-1α, to be present in conditioned medium of infectious leishmania as well as within macrophage cytosol after infection. To investigate secretion of potential effectors more broadly, we used quantitative mass spectrometry to analyze the protein content of conditioned medium collected from cultures of stationary-phase promastigotes of Leishmania donovani , an agent of visceral leishmaniasis. Results Analysis of leishmania conditioned medium resulted in the identification of 151 proteins apparently secreted by L. donovani . Ratios reflecting the relative amounts of each leishmania protein secreted, as compared to that remaining cell associated, revealed a hierarchy of protein secretion, with some proteins secreted to a greater extent than others. Comparison with an in silico approach defining proteins potentially exported along the classic eukaryotic secretion pathway suggested that few leishmania proteins are targeted for export using a classic eukaryotic amino-terminal secretion signal peptide. Unexpectedly, a large majority of known eukaryotic exosomal proteins was detected in leishmania conditioned medium, suggesting a vesicle-based secretion system. Conclusion This analysis shows that protein secretion by L. donovani is a heterogeneous process that is unlikely to be determined by a classical amino-terminal secretion signal. As an alternative, L. donovani appears to use multiple nonclassical secretion pathways, including the release of exosome-like microvesicles.