Abstract RyR1 is an intracellular Ca 2+ channel important in excitable cells. Ca 2+ activates it at low concentrations and inhibits it at high concentrations. Mg 2+ is the main physiological RyR1 inhibitor, an effect that is overridden upon activation. Despite the significance of Mg 2+ -mediated inhibition, the molecular-level mechanisms remain unclear. We determined two cryo-EM structures of RyR1 with Mg 2+ up to 2.8 Å resolution, identifying multiple Mg 2+ binding sites. Mg 2+ inhibits at the known Ca 2+ activating site and we propose that the EF hand domain is an inhibitory divalent cation sensor. Both divalent cations bind to ATP within a crevice, contributing to the precise transmission of allosteric changes within the enormous channel protein. Notably, Mg 2+ inhibits RyR1 by interacting with the gating helices as validated by molecular dynamics. This structural insight enhances our understanding of how Mg 2+ inhibition is overcome during excitation.

ABSTRACT Type 4 pili (T4P) are retractable surface appendages found on numerous bacteria and archaea that play essential roles in various microbial functions, including host colonization by pathogens. An ATPase is required for T4P extension, but the mechanism by which chemical energy is transduced to mechanical energy for pilus extension has not been elucidated. Here we report the cryo-electron microscopy (cryo-EM) structure of the BfpD ATPase from enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) in the presence of either ADP or a mixture of ADP and AMP-PNP. Both structures, solved at 3 Å resolution, reveal the typical toroid shape of AAA+ ATPases and unambiguous six-fold symmetry. This six-fold symmetry contrasts with the two-fold symmetry previously reported for other T4P extension ATPase structures, all of which were from thermophiles and solved by crystallography. In the presence of the nucleotide mixture, BfpD bound exclusively AMP-PNP and this binding resulted in a modest outward expansion in comparison to the structure in the presence of ADP, suggesting a concerted model for hydrolysis. De novo molecular models reveal a partially open configuration of all subunits where the nucleotide binding site may not be optimally positioned for catalysis. ATPase functional studies reveal modest activity similar to that of other extension ATPases, while calculations indicate that this activity is insufficient to power pilus extension. Our results reveal that, despite similarities in primary sequence and tertiary structure, T4P extension ATPases exhibit divergent quaternary configurations. Our data raise new possibilities regarding the mechanism by which T4P extension ATPases power pilus formation.

Abstract Activation of the intracellular Ca 2+ channel ryanodine receptor (RyR) triggers a cytosolic Ca 2+ surge, while elevated cytosolic Ca 2+ inhibits the channel in a negative feedback mechanism. Cryo-EM carried out under partially inactivating Ca 2+ conditions revealed two conformations of RyR1, an open state and an inactivated state, resolved at 4.0 and 3.3 Å resolution, respectively. RyR1s were embedded in nanodiscs with two lipids resolved at each inter-subunit crevice. Ca 2+ binding to the high affinity site engages the central (CD) and C-terminal domains (CTD) into a quasi-rigid unit, which separates the S6 four-helix bundle and opens the channel. Further out-of-plane rotation of the quasi-rigid unit pushes S6 towards the central axis, closing (inactivating) the channel. The inactivated conformation is characterized by a downward conformation of the cytoplasmic assembly, a tightly-knit subunit interface contributed by a fully occupied and partially remodeled Ca 2+ activation site, and two salt bridges between the EF hand domain and the S2-S3 loop of the neighboring subunit validated by naturally-occurring diseasecausing mutations. Ca 2+ also bound to ATP, mediating a tighter interaction between S6 and CTD. Our study suggests that the closed-inactivated is a distinctive state of the RyR1 and its transition to the closed-activable state is not a simple reverse of the Ca 2+ mediated activation pathway.