Summary

 Heterogeneity of lung tumor endothelial cell (TEC) phenotypes across patients, species (human/mouse), and models (in vivo/in vitro) remains poorly inventoried at the single-cell level. We single-cell RNA (scRNA)-sequenced 56,771 endothelial cells from human/mouse (peri)-tumoral lung and cultured human lung TECs, and detected 17 known and 16 previously unrecognized phenotypes, including TECs putatively regulating immune surveillance. We resolved the canonical tip TECs into a known migratory tip and a putative basement-membrane remodeling breach phenotype. Tip TEC signatures correlated with patient survival, and tip/breach TECs were most sensitive to vascular endothelial growth factor blockade. Only tip TECs were congruent across species/models and shared conserved markers. Integrated analysis of the scRNA-sequenced data with orthogonal multi-omics and meta-analysis data across different human tumors, validated by functional analysis, identified collagen modification as a candidate angiogenic pathway.

Abstract Purpose Pancreatic Ductal Adenocarcinoma (PDAC) remains a challenging disease due to its complex biology and aggressive behavior with an urgent need for efficient therapeutic strategies. To assess therapy response, pre-clinical PDAC organoid-based models in combination with accurate real-time monitoring are required. Methods We established stable live-imaging organoid/peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) co-cultures and introduced OrganoIDNet, a deep-learning-based algorithm, capable of analyzing bright-field images of murine and human patient-derived PDAC organoids acquired with live-cell imaging. We investigated the response to the chemotherapy gemcitabine in PDAC organoids and the PD-L1 inhibitor Atezolizumab, cultured with or without HLA-matched PBMCs over time. Results obtained with OrganoIDNet were validated with the endpoint proliferation assay CellTiter-Glo. Results Live cell imaging in combination with OrganoIDNet accurately detected size-specific drug responses of organoids to gemcitabine over time, showing that large organoids were more prone to cytotoxic effects. This approach also allowed distinguishing between healthy and unhealthy status and measuring eccentricity as organoids’ reaction to therapy. Furthermore, imaging of a new organoids/PBMCs sandwich-based co-culture enabled longitudinal analysis of organoid responses to Atezolizumab, showing an increased potency of PBMCs tumor-killing in an organoid-individual manner when Atezolizumab was added. Conclusion Optimized PDAC organoid imaging analyzed by OrganoIDNet represents a platform capable of accurately detecting organoid responses to standard PDAC chemotherapy over time. Moreover, organoid/immune cell co-cultures allow monitoring of organoid responses to immunotherapy, offering dynamic insights into treatment behavior within a co-culture setting with PBMCs. This setup holds promise for real-time assessment of immunotherapeutic effects in individual patient-derived PDAC organoids.

ABSTRACT The stress-associated molecular chaperone system is an actionable target in cancer therapies. It is ubiquitously upregulated in cancer tissues and enables tumorigenicity by stabilizing hundreds of oncoproteins and disturbing the stoichiometry of protein complexes. Most inhibitors target the key component heat-shock protein 90 (HSP90). However, although classical HSP90 inhibitors are highly tumor-selective, they fail in phase 3 clinical oncology trials. These failures are at least partly due to an interference with a negative feedback loop by HSP90 inhibition, known as heat-shock response (HSR): in response to HSP90 inhibition there is compensatory synthesis of stress-inducible chaperones, mediated by the transcription factor heat-shock factor 1 (HSF1). We recently identified that wildtype p53 (p53) actively reduces the HSR by repressing HSF1 via a p21-CDK4/6-MAPK-HSF1 axis. Here we test the hypothesis that in HSP90-based therapies simultaneous p53 activation or direct cell cycle inhibition interrupts the deleterious HSF1-HSR axis and improves the efficiency of HSP90 inhibitors. Indeed, we find that the clinically relevant p53 activator Idasanutlin suppresses the HSF1-HSR activity in HSP90 inhibitor-based therapies. This combination synergistically reduces cell viability and accelerates cell death in p53-proficient colorectal cancer (CRC) cells, murine tumor-derived organoids and patient-derived organoids (PDOs). Mechanistically, upon combination therapy human CRC cells strongly upregulate p53-associated pathways, apoptosis, and inflammatory immune pathways. Likewise, in the chemical AOM/DSS CRC model in mice, dual HSF1-HSP90 inhibition strongly represses tumor growth and remodels immune cell composition, yet displays only minor toxicities in mice and normal mucosa-derived organoids. Importantly, inhibition of the cyclin dependent kinases 4 and 6 (CDK4/6) under HSP90 inhibition phenocopies synergistic repression of the HSR in p53-proficient CRC cells. Even more important, in p53-deficient (mutp53-harboring) CRC cells, an HSP90 inhibition in combination with CDK4/6 inhibitors similarly suppresses the HSF1-HSR system and reduces cancer growth. Likewise, p53-mutated PDOs strongly respond to dual HSF1-HSP90 pathway inhibition and thus, providing a strategy to target CRC independent of the p53 status. In sum, activating p53 (in p53-proficient cancer cells) or inhibiting CDK4/6 (independent of the p53 status) provide new options to improve the clinical outcome of HSP90-based therapies and to enhance colorectal cancer therapy.

Endothelial cells (ECs) are highly plastic, capable of differentiating into various cell types. Endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) is crucial during embryonic development and contributes substantially to vascular dysfunction in many cardiovascular diseases (CVDs). While targeting EndMT holds therapeutic promise, understanding its mechanisms and modulating its pathways remain challenging. Using single-cell RNA sequencing on three in vitro EndMT models, we identified conserved gene signatures. We validated original regulators in vitro and in vivo during embryonic heart development and peripheral artery disease. EndMT induction led to global expression changes in all EC subtypes rather than in mesenchymal clusters. We identified mitochondrial calcium uptake as a key driver of EndMT; inhibiting mitochondrial calcium uniporter (MCU) prevented EndMT in vitro, and conditional