Abstract In colorectal cancer, oncogenic mutations transform a hierarchically organized and homeostatic epithelium into invasive cancer tissue lacking visible organization. We sought to define colorectal cancer cell types and signals controlling their development. More than 30,000 epithelial single cell transcriptomes of tumors and matched non-cancerous tissues of twelve colorectal cancer patients were clustered into six patient-overarching groups defined by differential activities of oncogenic signaling pathways such as mitogen-activated protein kinase and oncogenic traits such as replication stress. RNA metabolic labeling and assessment of RNA velocity in patient-derived organoids revealed developmental trajectories of colorectal cancer cells organized along a mitogen-activated protein kinase activity gradient. This was in contrast to normal colon organoid cells developing along graded Wnt activity. Experimental targeting of EGFR-BRAF-MEK in cancer organoids affected signaling and gene expression contingent on predictive KRAS/BRAF mutations and induced cell plasticity overriding default developmental trajectories, providing a basis for non-genetic resistance to targeted therapies.

Abstract Pancreatic Neuroendocrine Carcinomas (PanNECs) are high-grade, poorly-differentiated tumors grouped together with Pancreatic Neuroendocrine Tumors (PanNETs) and placed within the Pancreatic Neuroendocrine Neoplasms (PanNENs) WHO tumor classification. Despite recent studies suggesting the endocrine origin of low-grade PanNETs, high-grade PanNEC origin remains unknown. DNA methylation analysis using the Illumina 850K beadchip array was conducted on 57 PanNEN samples, including 14 PanNECs. Distinct methylation profiles separated PanNEN samples into two major groups, clearly distinguishing high-grade PanNECs from other PanNETs including high-grade NETG3. DNA mutations, copy number changes and Immunohistochemistry of pancreatic cell-type markers PDX1, ARX and SOX9 were utilized to further characterize PanNECs and their hierarchical cell of origin in the pancreas. Phylo-epigenetic and cell-type signature features using methylation data from normal alpha, beta, acinar and ductal adult cells indicate an exocrine cell of origin for PanNECs, thus separating them in cell lineage from other PanNENs of endocrine origin. Our study provides a robust and clinically relevant method relying on methylation profiles to clearly distinguish PanNECs from PanNETG3s to improve patient stratification and treatment.

Abstract Single-cell transcriptional profiling reveals cell heterogeneity and clinically relevant traits in intra-operatively collected patient-derived tissue. However, the established approach to perform such analyses on freshly collected tissue constitutes an important limitation since it requires prospective collection and immediate processing. Therefore, the ability to perform single-cell RNA sequencing from archived tissues would be very beneficial in a clinical setting. Here, we benchmark single-cell gene expression profiles from patient-matched fresh, cryopreserved and FFPE cancer tissue. We find that fresh tissue and FFPE routine blocks can be employed for the robust detection of clinically relevant traits on the single-cell level. Specifically, single-cell maps of fresh patient tissues and corresponding FFPE tissue blocks could be integrated into common low-dimensional representations, and cell subtype clusters showed highly correlated transcriptional strengths of signaling pathways, Hallmark and clinically useful signatures, despite some variability in expression of individual genes due to technological differences. FFPE tissue blocks revealed higher cell diversity compared to fresh tissue. In contrast, single-cell profiling of cryopreserved tissue was prone to artifacts in the clinical setting. Our analysis suggests that single-cell RNA sequencing from FFPE tissues is comparable to and can replace analyses from fresh tissue. This highlights the potential of single-cell profiling in the analysis of retrospectively and prospectively collected archival pathology cohorts and dramatically increases the applicability in translational projects.

ABSTRACT Epidemiological data demonstrate that SARS-CoV-2 variants of concern (VOC) B.1.1.7 and B.1.617.2 are more transmissible and infections are associated with a higher mortality than non-VOC virus infections. Phenotypic properties underlying their enhanced spread in the human population remain unknown. B.1.1.7 virus isolates displayed inferior or equivalent spread in most cell lines and primary cells compared to an ancestral B.1 SARS-CoV-2, and were outcompeted by the latter. Lower infectivity and delayed entry kinetics of B.1.1.7 viruses were accompanied by inefficient proteolytic processing of spike. B.1.1.7 viruses failed to escape from neutralizing antibodies, but slightly dampened induction of innate immunity. The bronchial cell line NCI-H1299 supported 24- and 595-fold increased growth of B.1.1.7 and B.1.617.2 viruses, respectively, in the absence of detectable ACE2 expression and in a spike-determined fashion. Superior spread in NCI-H1299 cells suggests that VOCs employ a distinct set of cellular cofactors that may be unavailable in standard cell lines.

Abstract Single-cell analyses can be confounded by assigning unrelated groups of cells to common developmental trajectories. For instance, cancer cells and admixed normal epithelial cells could potentially adopt similar cell states thus complicating analyses of their developmental potential. Here, we develop and benchmark CCISM (for Cancer Cell Identification using Somatic Mutations) to exploit genomic single nucleotide variants for the disambiguation of cancer cells from genomically normal non-cancer epithelial cells in single-cell data. In colorectal cancer datasets, we find that our method and others based on gene expression or allelic imbalances identify overlapping sets of cancer versus normal epithelial cells, depending on molecular characteristics of individual cancers. Further, we define consensus cell identities of normal and cancer epithelial cells with higher transcriptome cluster homogeneity than those derived using existing tools. Using the consensus identities, we identify significant shifts of cell state distributions in genomically normal epithelial cells developing in the cancer microenvironment, with immature states increased at the expense of terminal differentiation throughout the colon, and a novel stem-like cell state arising in the left colon. Trajectory analyses show that the new cell state extends the pseudo-time range of normal colon stem-like cells in a cancer context. We identify cancer-associated fibroblasts as sources of WNT and BMP ligands potentially contributing to increased plasticity of stem cells in the cancer microenvironment. Our analyses advocate careful interpretation of cell heterogeneity and plasticity in the cancer context and the consideration of genomic information in addition to gene expression data when possible. Novelty and Impact Single-cell analyses have become standard to assess cell heterogeneity and developmental hierarchies in cancer tissues. However, these datasets are complex and contain cancer and non-cancer lineage cells. Here, we develop and systematically benchmark tools to distinguish between cancer and non-cancer single-cell transcriptomes, based on gene expression or different levels of genomic information. We provide strategies to combine results of different tools into consensus calls tailored to the biology and genetic characteristics of the individual cancer.

Abstract Recent developments in immuno-oncology demonstrate that not only cancer cells, but also features of the tumor microenvironment guide precision medicine. Still, the relationship between tumor and microenvironment remains poorly understood. To overcome this limitation and identify clinically relevant microenvironmental and cancer features, we applied single-cell RNA sequencing to lung adenocarcinomas. While the highly heterogeneous carcinoma cell transcriptomes reflected histological grade and activity of relevant oncogenic pathways, our analysis revealed two distinct microenvironmental patterns. We identified a prognostically unfavorable group of tumors with a microenvironment composed of cancer-associated myofibroblasts, exhausted CD8+ T cells, proinflammatory monocyte-derived macrophages and plasmacytoid dendritic cells (CEP 2 pattern) and a prognostically favorable group characterized by myeloid dendritic cells, anti-inflammatory monocyte-derived macrophages, normal-like myofibroblasts, NK cells and conventional T cells (MAN 2 C pattern). Our results show that single-cell gene expression profiling allows to identify patient subgroups based on the tumor microenvironment beyond cancer cell-centric profiling.

The hypoxia-inducible transcription factor HIF-1 is appreciated as a promising target for cancer therapy. However, conditional deletion of HIF-1 and HIF-1 target genes in cells of the tumor microenvironment can result in accelerated tumor growth, calling for a detailed characterization of the cellular context to fully comprehend HIF-1's role in tumorigenesis. We dissected cell type-specific functions of HIF-1 for intestinal tumorigenesis by lineage-restricted deletion of the Hif1a locus. Intestinal epithelial cell-specific Hif1a loss reduced activation of wnt/b-catenin, tumor-specific metabolism and inflammation, significantly inhibiting tumor growth. Deletion of Hif1a in myeloid cells reduced the expression of fibroblast-activating factors in tumor-associated macrophages resulting in decreased abundance of tumor-associated fibroblasts and robustly reduced tumor formation. Interestingly, hypoxia was detectable only sparsely and without spatial association with nuclear HIF-1a in intestinal adenomas, pointing towards a functional importance of hypoxia-independent, i.e. non-canonical HIF-1 stabilization that has not been previously appreciated. This adds a further layer of complexity to the regulation of HIF-1a and suggests that hypoxia and HIF-1a stabilization can be uncoupled in cancer. Collectively, our data show that HIF-1 is a pivotal pro-tumorigenic factor for intestinal tumor formation, controlling key oncogenic programs in both the epithelial tumor compartment and the tumor microenvironment.

Mutations activating the KRAS GTPase or the BRAF kinase are frequent in colorectal cancer and are thought to constitutively activate the terminal mitogen-activated protein kinase, ERK. Using mass cytometry, we found graded phosphorylation of ERK anti-correlated with cell differentiation in patient-derived colorectal cancer organoids, independent of KRAS mutational status. Reporter, single cell transcriptome and mass cytometry analyses showed that transgenic KRASG12V activated ERK in a cell type-specific pattern in mouse intestinal organoids. In contrast, transgenic BRAFV600E triggered high ERK activity and downstream gene expression in all intestinal cell types, followed by epithelial disorganisation. Quantitative network modelling from perturbation data revealed that activation of ERK is shaped by cell type-specific MEK to ERK feed forward and negative feedback signalling. We identified dual-specificity phosphatases as candidate modulators of ERK activity between intestinal cell types. Furthermore, we find that oncogenic KRAS, together with β-Catenin, favours expansion of crypt cells with high ERK activity. Our experiments highlight key differences between ERK activity elicited by the BRAF or KRAS oncogenes in colorectal cancer and find unexpected heterogeneity in a signalling pathway with fundamental relevance for cancer therapy.

Abstract Colorectal cancer progression is intrinsically linked to stepwise deregulation of the intestinal differentiation trajectory. In this process, sequential mutations of APC/Wnt, KRAS, TP53 and SMAD4 stepwisely enable an oncogenic signalling network. Here, we developed a novel mass cytometry antibody panel to analyse colorectal cancer cell differentiation and signalling in human isogenic colorectal cancer organoids and in patient-derived cultures. We define a differentiation axis following EphrinB2 abundance in all tumour progression states from normal to cancer. We show that during colorectal cancer progression, oncogenes decrease dependence on external factors and shape distribution of cells along the differentiation axis. In this regard, subsequent mutations can have stem cell-promoting or restricting effects. Individual nodes of the signalling network remain coupled to the differentiation state, regardless of the presence of oncogenic signals. Our work underscores the key role of cell plasticity as a hallmark of cancer that is gradually unlocked during colorectal cancer progression.

Abstract Secondary resistance limits the clinical effectiveness of mutation-specific RAS inhibitors in colorectal cancer. It is unknown whether broad-spectrum RAS inhibitors meet similar limitations. Here, we identify and categorize mechanisms of resistance to the broad-spectrum active-state RAS inhibitor RMC-7977 in colorectal cancer cell lines. We found that KRAS-mutant colorectal cancer cell lines are universally sensitive to RMC-7977, inhibiting the RAS-RAF-MEK-ERK axis, halting proliferation and in some cases inducing apoptosis. To monitor KRAS downstream effector pathway activity, we developed a compartment-specific dual-color ERK activity reporter system. RMC-7977 treatment reduced reporter activity. However, long-term dose escalation with RMC-7977 revealed multiple patterns of reporter reactivation in emerging resistant cell populations that correlated with phosphorylation states of compartment-specific ERK targets. Cells sorted for high, low, or cytoplasmic reporter activity exhibited distinct patterns of genomic mutations, phospho-protein, and transcriptional activities. Notably, all resistant subpopulations showed dynamic ERK regulation in the presence of the RAS inhibitor, unlike the parental sensitive cell lines. High levels of RAS downstream activities were observed in cells characterized by a KRAS Y71H resistance mutation. In contrast, RAS inhibitor-resistant populations with low, or cytoplasmic ERK reporter reactivation displayed different genetic alterations, among them RAF1 S257L and S259P mutations. Colorectal cancer cells resistant to RMC-7977 and harboring the RAF1 mutation specifically exhibited synergistic sensitivity to concurrent RAS and RAF inhibition. Our findings endorse reporter-assisted screening together with single-cell analyses as a powerful approach for dissecting the complex landscape of therapy resistance. The strategy offers opportunities to develop clinically relevant combinatorial treatments to counteract emergence of resistant cancer cells.