Abstract Osteocyte apoptosis is spatially and temporally linked to bone fatigue-induced microdamage and to subsequent intracortical remodeling. Specifically, osteocytes surrounding fatigue microcracks in bone undergo apoptosis, and those regions containing apoptotic osteocytes co-localize exactly with areas subsequently resorbed by osteoclasts. Here we tested the hypothesis that osteocyte apoptosis is a key controlling step in the activation and/or targeting of osteoclastic resorption after bone fatigue. We carried out in vivo fatigue loading of ulna from 4- to 5-mo-old Sprague-Dawley rats treated with an apoptosis inhibitor (the pan-caspase inhibitor Q-VD-OPh) or with vehicle. Intracortical bone remodeling and osteocyte apoptosis were quantitatively assessed by standard histomorphometric techniques on day 14 after fatigue. Continuous exposure to Q-VD-OPh completely blocked both fatigue-induced apoptosis and the activation of osteoclastic resorption, whereas short-term caspase inhibition during only the first 2 days after fatigue resulted in >50% reductions in both osteocyte apoptosis and bone resorption. These results (1) show that osteocyte apoptosis is necessary to initiate intracortical bone remodeling in response to fatigue microdamage, (2) indicate a possible dose-response relationship between the two processes, and (3) suggest that early apoptotic events after fatigue-induced microdamage may play a substantial role in determining the subsequent course of tissue remodeling.

Using 2.1-µm high-resolution microcomputed tomography, we have examined the spatial distribution, clustering, and shape of nearly 35,000 microcalcifications (µCalcs) ≥ 5 µm in the fibrous caps of 22 nonruptured human atherosclerotic plaques. The vast majority of these µCalcs were <15 µm and invisible at the previously used 6.7-µm resolution. A greatly simplified 3D finite element analysis has made it possible to quickly analyze which of these thousands of minute inclusions are potentially dangerous. We show that the enhancement of the local tissue stress caused by particle clustering increases rapidly for gap between particle pairs (h)/particle diameter (D) < 0.4 if particles are oriented along the tensile axis of the cap. Of the thousands of µCalcs observed, there were 193 particle pairs with h/D ≤ 2 (tissue stress factor > 2), but only 3 of these pairs had h/D ≤ 0.4, where the local tissue stress could increase a factor > 5. Using nondecalcified histology, we also show that nearly all caps have µCalcs between 0.5 and 5 µm and that the µCalcs ≥ 5 µm observed in high-resolution microcomputed tomography are agglomerations of smaller calcified matrix vesicles. µCalcs < 5 µm are predicted to be not harmful, because the tiny voids associated with these very small particles will not explosively grow under tensile forces because of their large surface energy. These observations strongly support the hypothesis that nearly all fibrous caps have µCalcs, but only a small subset has the potential for rupture.

Abstract To date, the cell and molecular mechanisms regulating tendon healing are poorly understood. Here, we establish a novel model of tendon regeneration using neonatal mice and show that neonates heal via formation of a ‘neo-tendon’ that differentiates along the tendon specific lineage with functional restoration of gait and mechanical properties. In contrast, adults heal via fibrovascular scar, aberrant differentiation toward cartilage and bone, with persistently impaired function. Lineage tracing identified intrinsic recruitment of Scx-lineage cells as a key cellular mechanism of neonatal healing that is absent in adults. Instead, adult Scx-lineage tenocytes are not recruited into the defect but transdifferentiate into ectopic cartilage; in the absence of tenogenic cells, extrinsic αSMA-expressing cells persist to form a permanent scar. Collectively, these results establish an exciting model of tendon regeneration and uncover a novel cellular mechanism underlying regenerative vs non-regenerative tendon healing.

The role of microcalcifications (μCalcs) in the biomechanics of vulnerable plaque rupture is examined. Our laboratory previously proposed (Ref. 44 ), using a very limited tissue sample, that μCalcs embedded in the fibrous cap proper could significantly increase cap instability. This study has been greatly expanded. Ninety-two human coronary arteries containing 62 fibroatheroma were examined using high-resolution microcomputed tomography at 6.7-μm resolution and undecalcified histology with special emphasis on calcified particles <50 μm in diameter. Our results reveal the presence of thousands of μCalcs, the vast majority in lipid pools where they are not dangerous. However, 81 μCalcs were also observed in the fibrous caps of nine of the fibroatheroma. All 81 of these μCalcs were analyzed using three-dimensional finite-element analysis, and the results were used to develop important new clinical criteria for cap stability. These criteria include variation of the Young's modulus of the μCalc and surrounding tissue, μCalc size, and clustering. We found that local tissue stress could be increased fivefold when μCalcs were closely spaced, and the peak circumferential stress in the thinnest nonruptured cap (66 μm) if no μCalcs were present was only 107 kPa, far less than the proposed minimum rupture threshold of 300 kPa. These results and histology suggest that there are numerous μCalcs < 15 μm in the caps, not visible at 6.7-μm resolution, and that our failure to find any nonruptured caps between 30 and 66 μm is a strong indication that many of these caps contained μCalcs.

ABSTRACT Intramuscular fatty infiltration in muscle injuries and diseases, caused by aberrant adipogenesis of fibro-adipogenic progenitors, negatively impacts function. Intramuscular delivery of Wnt7a offers a promising strategy to stimulate muscle regeneration but its effects on adipogenic conversion of fibro-adipogenic progenitors remain unknown. Here we show that Wnt7a inhibits adipogenesis of FAPs through the alternative Wnt-Rho-YAP/TAZ signaling that subsequently upregulates the canonical Wnt pathway. Furthermore, intramuscular injection of Wnt7a in vivo effectively suppresses fatty infiltration in mice. Our results collectively suggest Wnt7a as a potential protein-based therapeutic for inhibiting adipogenesis of FAPs and intramuscular fatty infiltration in pathological muscle injuries or diseases.

BACKGROUND CONTEXT : Endplate (EP) injury plays critical roles in painful IVD degeneration since Modic changes (MCs) are highly associated with pain. Models of EP microfracture that progress to painful conditions are needed to better understand pathophysiological mechanisms and screen therapeutics. PURPOSE : Establish in vivo rat lumbar EP microfracture model with painful phenotype. STUDY DESIGN/SETTING : In vivo rat study to characterize EP-injury model with characterization of IVD degeneration, vertebral bone marrow remodeling, spinal cord sensitization, and pain-related behaviors. METHODS : EP-driven degeneration was induced in 5-month-old male Sprague-Dawley rats L4-5 and L5-6 IVDs through the proximal vertebral body injury with intradiscal injections of TNFα (n=7) or PBS (n=6), compared to Sham (surgery without EP-injury, n=6). The EP-driven model was assessed for IVD height, histological degeneration, pain-like behaviors (hindpaw von Frey and forepaw grip test), lumbar spine MRI and μCT analyses, and spinal cord substance P (SubP). RESULTS : EP injuries induced IVD degeneration with decreased IVD height and MRI T2 values. EP injury with PBS and TNFα both showed MC type1-like changes on T1 and T2-weighted MRI, trabecular bone remodeling on μCT, and damage in cartilage EP adjacent to the injury. EP injuries caused significantly decreased paw withdrawal threshold and reduced grip forces, suggesting increased pain sensitivity and axial spinal discomfort. Spinal cord dorsal horn SubP was significantly increased, indicating spinal cord sensitization. CONCLUSIONS : EP microfracture can induce crosstalk between vertebral bone marrow, IVD and spinal cord with chronic pain-like conditions. CLINICAL SIGNIFICANCE : This rat EP microfracture model of IVD degeneration was validated to induce MC-like changes and pain-like behaviors that we hope will be useful to screen therapies and improve treatment for EP-drive pain.

Back pain is a leading cause of disability strongly associated with intervertebral disc (IVD) degeneration. Reducing structural disruption and catabolism in IVD degeneration remains an important clinical challenge. Pro-oxidant and structure-modifying advanced glycation end-products (AGEs) contribute to obesity and diabetes, which are associated with increased back pain, and accumulate in tissues due to hyperglycemia or ingestion of foods processed at high heat. Collagen-rich IVDs are particularly susceptible to AGE accumulation due to their slow metabolic rates yet it is unclear if dietary AGEs can cross the endplates to accumulate in IVDs. We apply a dietary mouse model to test the hypothesis that chronic consumption of high AGE diets results in sex-specific IVD structural disruption and functional changes. High AGE diet resulted in AGE accumulation in IVDs and increased IVD compressive stiffness, torque range, and failure torque, particularly for females. These biomechanical changes were likely caused by significantly increased AGE crosslinking in the annulus fibrosus, measured by multiphoton imaging. Increased collagen damage measured with collagen hybridizing peptide may be a risk factor for IVD degeneration as these animals age. The greater influence of high AGE diet on females is an important area of future investigation that may involve AGE receptors, known to interact with estrogen. We conclude high AGE diets can be a source for IVD crosslinking and collagen damage known to be important in IVD degeneration. This suggests dietary and other interventions that modify AGEs warrant further investigation and may be particularly important for diabetics where AGEs accumulate more rapidly.

Abstract Purpose Tendon- or ligament-to-bone repair remains a surgical challenge. While bone tunnel fixation is a common surgical technique whereby soft tissue is expected to heal against a bone tunnel interface, contemporary methods have yet to recapitulate biomechanical similarity to the native enthesis. In this study, we aim to demonstrate that inside-out longitudinal tendon inversion may improve bone tunnel healing with the hypothesis that inversion removes the gliding epitenon surface from the healing interface thereby improving tunnel interface healing. Methods 40 male Sprague-Dawley rats underwent either native tendon tenodesis (control group) or tendon inversion tenodesis (experimental group). Interface tissue was harvested 8 weeks post-operatively. Biomechanical testing was performed to assess tensile strength and modes of failure. Histology was performed to assess tissue architecture, and immunohistochemistry was used confirmed abrogation of epitendinous lubricin from interface tissue. Results Neither surgical intervention led to discernible adverse effects on animal health. Maximum tensile strength increased after tendon inversion compared to control surgery. The extracellular matrix protein lubricin was reduced with tendon inversion, and specimens with tendon inversion had greater healing scores and collagen fibril alignment at the healing interface. Conclusions Tendon inversion improves bone tunnel healing in rats. Clinical Relevance Our findings suggest that longitudinal tendon inversion, or inverse tubularization, in a rat biceps tenodesis model improves tendon-to-bone healing in part due to disruption of the epitendinous surface at the bone healing interface. This work provides molecular insight into future improvements for tendon-to-bone repair surgical techniques.

Abstract Intervertebral disc (IVD) degeneration (IVDD) progresses to herniation and back pain due to the poor IVD healing capacities. However, factors contributing to inferior IVD repair remain to be elucidated. Here we identify distinct roles of TNFα-receptors (TNFRs) in IVD cell responses to back pain conditions as key factors in poor IVD healing responses. IVDD tissue of back pain subjects with herniation secreted a complex array of pro-inflammatory cytokines and chemokines (including IL-6, IL-10, CCL2 and CCL5) collected as IVDD conditioned media (IVDD-CM). Single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) of human IVDD tissues revealed these cytokines were dominantly expressed by a small macrophage-population with surprisingly low expression by native IVD cells. Human annulus fibrosus (hAF) cells from surgical tissue had reduced metabolic rates and underwent senescence in IVDD-CM, whereas Basal media restored mitotic potential. Inhibiting the TNFR1 pathway in hAF cells under IVDD-CM challenge enhanced proliferation and induced pro-inflammatory responses with extensive cytokines and chemokines produced. Surprisingly, modulating the pro-reparative TNFR2 using blocking antibodies or using Atsttrin as TNFR2 activator had no effect on hAF cell transcriptome. We discovered TNFR2 was lacking on hIVD cell membranes using immunostaining and scRNA-seq on human autopsy samples and back pain tissue. The absence of TNFR2 on hIVD cells is a new finding revealing these cells are inherently limited in their repair response to inflammatory challenges. Results point to a TNFR-specific strategy for IVD repair involving TNFR1 inhibition to restore IVD cell metabolism and express chemokines to recruit TNFR2-expressing cells capable of a more robust repair response.