Fibrosis is a hallmark in the pathogenesis of various diseases, with very limited therapeutic solutions. A key event in the fibrotic process is the expression of contractile proteins, including α-smooth muscle actin (αSMA) by fibroblasts, which become myofibroblasts. Here, we report the results of a high-throughput screening of a library of approved drugs that led to the discovery of haloperidol, a common antipsychotic drug, as a potent inhibitor of myofibroblast activation. We show that haloperidol exerts its antifibrotic effect on primary murine and human fibroblasts by binding to sigma receptor 1, independent from the canonical transforming growth factor-β signaling pathway. Its mechanism of action involves the modulation of intracellular calcium, with moderate induction of endoplasmic reticulum stress response, which in turn abrogates Notch1 signaling and the consequent expression of its targets, including αSMA. Importantly, haloperidol also reduced the fibrotic burden in 3 different animal models of lung, cardiac, and tumor-associated fibrosis, thus supporting the repurposing of this drug for the treatment of fibrotic conditions.

Abstract Compound repurposing is an important strategy for the identification of effective treatment options against SARS-CoV-2 infection and COVID-19 disease. In this regard, SARS-CoV-2 main protease (3CL-Pro), also termed M-Pro, is an attractive drug target as it plays a central role in viral replication by processing the viral polyproteins pp1a and pp1ab at multiple distinct cleavage sites. We here report the results of a repurposing program involving 8.7 K compounds containing marketed drugs, clinical and preclinical candidates, and small molecules regarded as safe in humans. We confirmed previously reported inhibitors of 3CL-Pro, and have identified 62 additional compounds with IC 50 values below 1 μM and profiled their selectivity towards Chymotrypsin and 3CL-Pro from the MERS virus. A subset of 8 inhibitors showed anti-cytopathic effect in a Vero-E6 cell line and the compounds thioguanosine and MG-132 were analysed for their predicted binding characteristics to SARS-CoV-2 3CL-Pro. The X-ray crystal structure of the complex of myricetin and SARS-Cov-2 3CL-Pro was solved at a resolution of 1.77 Å, showing that myricetin is covalently bound to the catalytic Cys145 and therefore inhibiting its enzymatic activity. Graphical abstract Abstract Figure. Workflow for identification and profiling of inhibitors of SARS-CoV-2 3CL-Pro using a large scale repurposing and bioactive compound collection (rhs). Primary assay principle based on quenched FRET peptide substrate of SARS-CoV-2 3CL-Pro (lhs). Inhibiting compounds reduce fluorescence signal relative to DMSO controls. Hit profiling using X-ray.

We present, here, an open-source systems biology toolkit to simulate mathematical models of the signal-transduction pathways of G-protein coupled receptors (GPCRs). By merging structural macromolecular data with systems biology simulations, we developed a framework to simulate the signal-transduction kinetics induced by ligand-GPCR interactions, as well as the consequent change of concentration of signaling molecular species, as a function of time and ligand concentration. Therefore, this tool brings to the light the possibility to investigate the subcellular effects of ligand binding upon receptor activation, deepening the understanding of the relationship between the molecular level of ligand-target interactions and higher-level cellular and physiologic or pathological response mechanisms.

Abstract The SARS-CoV-2 coronavirus outbreak continues to spread at a rapid rate worldwide. The main protease (Mpro) is an attractive target for anti-COVID-19 agents. Unfortunately, unexpected difficulties have been encountered in the design of specific inhibitors. Here, by analyzing an ensemble of ~30,000 SARS-CoV-2 Mpro conformations from crystallographic studies and molecular simulations, we show that small structural variations in the binding site dramatically impact ligand binding properties. Hence, traditional druggability indices fail to adequately discriminate between highly and poorly druggable conformations of the binding site. By performing ~200 virtual screenings of compound libraries on selected protein structures, we redefine the protein’s druggability as the consensus chemical space arising from the multiple conformations of the binding site formed upon ligand binding. This procedure revealed a unique SARS-CoV-2 Mpro blueprint that led to a definition of a specific structure-based pharmacophore. The latter explains the poor transferability of potent SARS-CoV Mpro inhibitors to SARS-CoV-2 Mpro, despite the identical sequences of the active sites. Importantly, application of the pharmacophore predicted novel high affinity inhibitors of SARS-CoV-2 Mpro, that were validated by in vitro assays performed here and by a newly solved X-ray crystal structure. These results provide a strong basis for effective rational drug design campaigns against SARS-CoV-2 Mpro and a new computational approach to screen protein targets with malleable binding sites.

Abstract The KIT D816V mutation is found in more than 80% of patients with systemic mastocytosis (SM) and is key to neoplastic mast cell (MC) expansion and accumulation in affected organs. KIT D816V therefore represents a prime therapeutic target for SM. Here we generated a panel of patient-specific KIT D816V induced pluripotent stem cells (iPSCs) from patients with aggressive SM (ASM) and mast cell leukemia (MCL) to develop a patient-specific SM disease model for mechanistic and drug discovery studies. KIT D816V iPSCs differentiated into neoplastic hematopoietic progenitor cells and MCs with patient-specific phenotypic features, thereby reflecting the heterogeneity of the disease. CRISPR/Cas9n-engineered KIT D816V human embryonic stem cells (ESCs), when differentiated into hematopoietic cells, recapitulated the phenotype observed for KIT D816V iPSC hematopoiesis. KIT D816V causes constitutive activation of the KIT tyrosine kinase receptor and we exploited our iPSCs and ESCs to investigate new tyrosine kinase inhibitors targeting KIT D816V. Our study identified nintedanib as a novel KIT D816V inhibitor. Nintedanib selectively reduced the viability of iPSC-derived KIT D816V hematopoietic progenitor cells and MCs in the nanomolar range. Nintedanib was also active on primary samples of KIT D816V SM patients. Molecular docking studies show that nintedanib binds to the ATP binding pocket of inactive KIT D816V. Our results suggest nintedanib as a new drug candidate for KIT D816V targeted therapy of advanced SM.

Cholesterol is a major component of plasma membranes and plays a significant role in actively regulating the functioning of several membrane proteins in humans. In this study, we focus on the role of cholesterol depletion on the voltage-gated sodium channel Na

Abstract A variety of enhanced sampling methods can predict free energy landscapes associated with protein/ligand binding events, characterizing in a precise way the intermolecular interactions involved. Unfortunately, these approaches are challenged by not uncommon induced fit mecchanisms. Here, we present a variant of the recently reported volume-based metadynamics (MetaD) method which describes ligand binding even when it affects protein structure. The validity of the approach is established by applying it to a substrate/enzyme complexes of pharmacological relevance: this is the mono-ADP-ribose (ADPr) in complex with mono-ADP-ribosylation hydrolases (MacroD1 and MacroD2), where induced-fit phenomena are known to be operative. The calculated binding free energies are consistent with experiments, with an absolute error less than 0.5 kcal/mol. Our simulations reveal that in all circumstances the active loops, delimiting the boundaries of the binding site, rearrange from an open to a closed conformation upon ligand binding. The calculations further provide, for the first time, the molecular basis of the experimentally observed affinity changes in ADPr binding on passing from MacroD1 to MacroD2 and all its mutants. Our study paves the way to investigate in a completely general manner ligand binding to proteins and receptors.

Abstract Polyglutamine (polyQ) diseases are characterized by an expansion of cytosine-adenine-guanine (CAG) trinucleotide repeats encoding for an uninterrupted prolonged polyQ tract. We previously identified TRMT2A as a strong modifier of polyQ-induced toxicity in an unbiased large-scale screen in Drosophila melanogaster . This work aimed at identifying and validating pharmacological TRMT2A inhibitors as treatment opportunities for polyQ diseases in humans. Computer-aided drug discovery was implemented to identify human TRMT2A inhibitors. Additionally, the crystal structure of one protein domain, the RNA recognition motif (RRM), was determined, and Biacore experiments with the RRM were performed. The identified molecules were validated for their potency to reduce polyQ aggregation and polyQ-induced cell death in human HEK293T cells and patient derived fibroblasts. Our work provides a first step towards pharmacological inhibition of this enzyme and indicates TRMT2A as a viable drug target for polyQ diseases.

In recent years native mass spectrometry has been increasingly employed to study protein structure. As such a thorough understanding of the effect of the gas-phase on protein structure is becoming increasingly important. We show how a combination of top-down ETD and ion mobility can be used to probe the gas-phase structure of heterogeneous protein ensembles. By applying collisional activation to the non-covalently bound ETD products after IM separation, the peptide fragments can be released while maintaining the conformational information of the protein ion. We studied the unknown gas-phase structures of the measles virus (MeV) phosphoprotein X domain (PXD), which shows a wide range of different conformations in the gas-phase. We then generated structural models by state-of-the-art gas-phase steered molecular dynamics, which we verified using restraints from ion mobility and the fragment patterns observed. Our findings illustrate the applicability of ETD for obtaining conformational specific structural information on heterogeneous protein ensembles.

Abstract Cholesterol is a major component of plasma membranes and unsurprisingly plays a significant role in actively regulating the functioning of several membrane proteins in humans. Notably, recent studies have shown that cholesterol depletion can also impact transmission of potentially painful signals in the context of peripheral inflammation, via hyperexcitability of the voltage-gated sodium channel (Na v ) subtype 1.9, but the structural mechanisms underlying this regulation remain to be elucidated. In this study, we focus on the role of cholesterol depletion on Na v 1.7, which is primarily expressed in the peripheral sensory neurons and linked to various chronic inherited pain syndromes. Coarse-grained molecular dynamics simulations shed light on the dynamic changes of the geometry of Na v 1.7 upon membrane cholesterol depletion: A loss of rigidity at key structural motifs linked to activation and fast-inactivation is observed, as well as changes in the geometry of drug-binding regions in the channel. Loss of rigidity in cholesterol depleted conditions should allow the channel to transition between different gating states more easily. In-vitro whole-cell patch clamp experiments on HEK293t cells expressing Na v 1.7 validated these predictions made in silico at the functional level. Hyperpolarizing shifts in the voltage-dependence of activation and fast-inactivation were observed along with an acceleration of the time to peak and onset kinetics of fast inactivation. These results underline the critical role of membrane composition, and of cholesterol in particular, in influencing Na v 1.7 gating characteristics. Furthermore, our results hint to a key role of the membrane environment in affecting drug effects and in pathophysiological dysregulation, sharpening our approaches for analgesics design. Supplementary data https://doi.org/10.5281/zenodo.10829175