Peripheral blood MФ–cancer cell fusion hybrids identified in cancer patients correlate with disease stage and overall survival.

Senescent cells accumulate in tissues over time as part of the natural ageing process and the removal of senescent cells has shown promise for alleviating many different age-related diseases in mice. Cancer is an age-associated disease and there are numerous mechanisms driving cellular senescence in cancer that can be detrimental to recovery. Thus, it would be beneficial to develop a senolytic that acts not only on ageing cells but also senescent cancer cells to prevent cancer recurrence or progression.We used molecular modelling to develop a series of rationally designed peptides to mimic and target FOXO4 disrupting the FOXO4-TP53 interaction and releasing TP53 to induce apoptosis. We then tested these peptides as senolytic agents for the elimination of senescent cells both in cell culture and in vivo.Here we show that these peptides can act as senolytics for eliminating senescent human cancer cells both in cell culture and in orthotopic mouse models. We then further characterized one peptide, ES2, showing that it disrupts FOXO4-TP53 foci, activates TP53 mediated apoptosis and preferentially binds FOXO4 compared to TP53. Next, we show that intratumoural delivery of ES2 plus a BRAF inhibitor results in a significant increase in apoptosis and a survival advantage in mouse models of melanoma. Finally, we show that repeated systemic delivery of ES2 to older mice results in reduced senescent cell numbers in the liver with minimal toxicity.Taken together, our results reveal that peptides can be generated to specifically target and eliminate FOXO4+ senescent cancer cells, which has implications for eradicating residual disease and as a combination therapy for frontline treatment of cancer.This work was supported by the Cancer Early Detection Advanced Research Center at Oregon Health & Science University.

Abstract Metastatic progression defines the final stages of tumor evolution and underlies the majority of cancer-related deaths. The heterogeneity in disseminated tumor cell populations capable of seeding and growing in distant organ sites contributes to the development of treatment resistant disease. We recently reported the identification of a novel tumor-derived cell population, circulating hybrid cells (CHCs), harboring attributes from both macrophages and neoplastic cells, including functional characteristics important to metastatic spread. These disseminated hybrids outnumber conventionally defined circulating tumor cells (CTCs) in cancer patients. It is unknown if CHCs represent a generalized cancer mechanism for cell dissemination, or if this population is relevant to the metastatic cascade. Herein, we detect CHCs in the peripheral blood of patients with cancer in myriad disease sites encompassing epithelial and non-epithelial malignancies. Further, we demonstrate that in vivo-derived hybrid cells harbor tumor-initiating capacity in murine cancer models and that CHCs from human breast cancer patients express stem cell antigens, features consistent with the ability to seed and grow at metastatic sites. Finally, we reveal heterogeneity of CHC phenotypes reflect key tumor features, including oncogenic mutations and functional protein expression. Importantly, this novel population of disseminated neoplastic cells opens a new area in cancer biology and renewed opportunity for battling metastatic disease. Simple Summary There is an incomplete understanding of circulating neoplastic cell populations and the fundamental mechanisms that drive dissemination, immune evasion, and growth —all critical information to more effectively prevent and treat cancer progression. A novel disseminated tumor cell population, circulating hybrid cells, are detected across many cancer types and carry functional tumor-initiating properties. Additionally, circulating hybrid cells are found at significantly higher levels than conventionally defined circulating tumor cells. Our study demonstrates that neoplastic hybrid cells harbor phenotypic and genetic characteristics of tumor and immune cells, display stem features, and are a generalizable phenomenon in solid tumors. Circulating hybrid cells therefore have relevance as a novel biomarker and open a new field of study in malignancy.

Tumor protein p63 (TP63) is a member of the TP53 protein family that are important for development and in tumor suppression. Unlike TP53, TP63 is rarely mutated in cancer, but instead different TP63 isoforms regulate its activity. TA isoforms (TAp63) act as tumor suppressors, whereas ΔN isoforms are strong drivers of squamous or squamous-like cancers. Many of these tumors become addicted to ΔN isoforms and removal of ΔN isoforms result in cancer cell death. Furthermore, some TP53 conformational mutants (TP53CM) gain the ability to interact with TAp63 isoforms and inhibit their antitumorigenic function, while indirectly promoting tumorigenic function of ΔN isoforms, but the exact mechanism of TP63-TP53CM interaction is unclear. The changes in the balance of TP63 isoform activity are crucial to understanding the transition between normal and tumor cells. Here, we modeled TP63-TP53CM complex using computational approaches. We then used our models to design peptides to disrupt the TP63-TP53CM interaction and restore antitumorigenic TAp63 function. In addition, we studied ΔN isoform oligomerization and designed peptides to inhibit its oligomerization and reduce their tumorigenic activity. We show that some of our peptides promoted cell death in a TP63 highly expressed cancer cell line, but not in a TP63 lowly expressed cancer cell line. Furthermore, we performed kinetic-binding assays to validate binding of our peptides to their targets. Our computational and experimental analyses present a detailed model for the TP63-TP53CM interaction and provide a framework for potential therapeutic peptides for the elimination of TP53CM cancer cells.

Supplementary Data from Computational Modeling of TP63–TP53 Interaction and Rational Design of Inhibitors: Implications for Therapeutics

<div>Abstract<p>Tumor protein p63 (TP63) is a member of the TP53 protein family that are important for development and in tumor suppression. Unlike TP53, TP63 is rarely mutated in cancer, but instead different TP63 isoforms regulate its activity. TA isoforms (TAp63) act as tumor suppressors, whereas ΔN isoforms are strong drivers of squamous or squamous-like cancers. Many of these tumors become addicted to ΔN isoforms and removal of ΔN isoforms result in cancer cell death. Furthermore, some TP53 conformational mutants (TP53^CM) gain the ability to interact with TAp63 isoforms and inhibit their antitumorigenic function, while indirectly promoting tumorigenic function of ΔN isoforms, but the exact mechanism of TP63–TP53^CM interaction is unclear. The changes in the balance of TP63 isoform activity are crucial to understanding the transition between normal and tumor cells. Here, we modeled TP63–TP53^CM complex using computational approaches. We then used our models to design peptides to disrupt the TP63–TP53^CM interaction and restore antitumorigenic TAp63 function. In addition, we studied ΔN isoform oligomerization and designed peptides to inhibit its oligomerization and reduce their tumorigenic activity. We show that some of our peptides promoted cell death in a TP63 highly expressed cancer cell line, but not in a TP63 lowly expressed cancer cell line. Furthermore, we performed kinetic–binding assays to validate binding of our peptides to their targets. Our computational and experimental analyses present a detailed model for the TP63–TP53^CM interaction and provide a framework for potential therapeutic peptides for the elimination of TP53^CM cancer cells.</p></div>

<div>Abstract<p>Tumor protein p63 (TP63) is a member of the TP53 protein family that are important for development and in tumor suppression. Unlike TP53, TP63 is rarely mutated in cancer, but instead different TP63 isoforms regulate its activity. TA isoforms (TAp63) act as tumor suppressors, whereas ΔN isoforms are strong drivers of squamous or squamous-like cancers. Many of these tumors become addicted to ΔN isoforms and removal of ΔN isoforms result in cancer cell death. Furthermore, some TP53 conformational mutants (TP53^CM) gain the ability to interact with TAp63 isoforms and inhibit their antitumorigenic function, while indirectly promoting tumorigenic function of ΔN isoforms, but the exact mechanism of TP63–TP53^CM interaction is unclear. The changes in the balance of TP63 isoform activity are crucial to understanding the transition between normal and tumor cells. Here, we modeled TP63–TP53^CM complex using computational approaches. We then used our models to design peptides to disrupt the TP63–TP53^CM interaction and restore antitumorigenic TAp63 function. In addition, we studied ΔN isoform oligomerization and designed peptides to inhibit its oligomerization and reduce their tumorigenic activity. We show that some of our peptides promoted cell death in a TP63 highly expressed cancer cell line, but not in a TP63 lowly expressed cancer cell line. Furthermore, we performed kinetic–binding assays to validate binding of our peptides to their targets. Our computational and experimental analyses present a detailed model for the TP63–TP53^CM interaction and provide a framework for potential therapeutic peptides for the elimination of TP53^CM cancer cells.</p></div>

Background: Senescent cells accumulate in tissues over time as part of the natural aging process and the removal of senescent cells has shown promise for alleviating many different age-related diseases in mice. Cancer is an age-associated disease and there are numerous mechanisms driving cellular senescence in cancer that can be detrimental to recovery. Thus, it would be beneficial to eliminate senescent cancer cells to prevent cancer recurrence or progression. Methods: We used molecular modeling to develop a series of rationally designed peptides to mimic and target FOXO4 disrupting the FOXO4-TP53 interaction and releasing TP53 to induce apoptosis. We then tested these peptides as senolytic agents for the elimination of senescent cancer cells both in cell culture and in vivo.Findings: Here we show that these peptides can act as senolytics for eliminating senescent human cancer cells both in cell culture and in orthotopic mouse models. We then further characterized one peptide, ES2, showing that it co-localizes with FOXO4 foci and binds FOXO4 to a greater extent compared to TP53. Finally, we show that concomitant intra-tumoral injection of ES2 plus a BRAF inhibitor results in a significant increase in apoptosis in a transgenic mouse model of melanoma. Interpretation: Taken together, our results reveal that peptides can be generated to specifically eliminate FOXO4+ senescent cancer cells, which has implications for eradicating residual disease and as a combination therapy for frontline treatment of cancer.Funding Statement: This work was supported by the Cancer Early Detection Advanced Research Center at Oregon Health & Science University.Declaration of Interests: S.S. Cinaroglu, Y. Ahiska, U. Sezerman, G.B. Akcapinar, E. Timucin have a patent for the ES2 structure and are members of a company, Eternans Ltd. that is working on ES2 for therapeutic use. No potential conflicts of interest were disclosed by the other authors.Ethics Approval Statement: All experiments were approved by Oregon Health and Science University (OHSU) Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (TR01_IP00000674) and conformed to the guidelines set by United States Animal Welfare Act and the National Institutes of Health.

Abstract Lungs are a frequent site for disease but are difficult to image and probe, potentially exacerbating lung disease, delaying diagnoses and impacting survival. Here, we demonstrate a low cost, minimally invasive method to probe the lungs for disease, using genetically engineered Lactiplantibacillus plantarum strain WCFS1. Genetically modified WCFS1 was delivered specifically to the lungs of mice, where it was shown to remain transcriptionally active for several hours and then be cleared without further colonization. WCFS1 was further modified to secrete nanoluciferase as a synthetic biomarker, which traveled from the bacteria in the lung to the urine where it was easily detected. The administered bacteria also secreted nano-luciferase upon detecting a specific peptide secreted by a mouse lung cancer cell line in vitro or in vivo from syngeneic tumors.

Abstract p63 plays a central role in limb formation and epithelial differentiation. p63, reported to correlate with cancer formation, is rarely mutated in cancers. Different p63 isoforms can have anti-tumorigenic or pro-tumorigenic activity. TA isoforms act as tumor suppressor by promoting cell death, while deltaN isoforms are strong driver for squamous/squamous-like cancers including lung, head and neck, cervical, skin and pancreas. A large number of tumors are addicted to deltaN isoforms. Furthermore, cancer associated p53R175H mutant gains ability to interact with TAp63 isoforms and inhibit their anti-tumorigenic function, while indirectly promoting tumorigenic function of deltaN isoforms. However, the exact mechanism of p53R175H-p63 interaction is unclear. The changes in the balance of p63 isoform activity are likely to be crucial to understanding the transition between normal cell and tumor formation. Here, we modelled p53R175H-p63 complex using homology modelling, flexible/unbiased docking and molecular dynamics simulations. Moreover, we used our models to design peptides to disrupt p53R175H-p63 interaction and restore anti-tumorigenic function of TAp63 isoforms. Also, we studied deltaN isoform oligomerization and designed peptides to inhibit their oligomerization to reduce their tumorigenic activity. We showed that some of our peptides promoted cell death in a p63 enriched cancel cell line. We characterized our peptides performing kinetic binding assays to validate binding of our peptides to their designated targets. In this study, our computational and experimental analyses presented a detailed model for the p53R175H-p63 interaction. We also provided a framework for potential therapeutic peptides to outweigh the balance in the advantage of anti-tumorigenic p63 activity. Citation Format: E. Sila Ozdemir, Michelle Gomes, Jared Fischer. Targeting p63 isoforms in cancer to restore their anti-tumorigenic activity [abstract]. In: Proceedings of the American Association for Cancer Research Annual Meeting 2022; 2022 Apr 8-13. Philadelphia (PA): AACR; Cancer Res 2022;82(12_Suppl):Abstract nr 3358.