Abstract Cyanobacteria have evolved a remarkably powerful CO 2 concentrating mechanism (CCM), enabling high photosynthetic rates in environments with limited inorganic carbon (Ci). Therefore, this CCM is a promising system for integration into higher plant chloroplasts to boost photosynthetic efficiency and yield. The CCM depends on active Ci uptake, facilitated by bicarbonate transporters and CO 2 pumps, to elevate CO 2 concentration around the active sites of the primary CO 2 fixing enzyme, Rubisco, which is encapsulated in cytoplasmic micro-compartments (carboxysomes). The essential CCM proteins have been identified, but the molecular signals and regulators that coordinate function in response to light, Ci availability and other environmental cues are largely unknown. Here, we provide evidence, based on a novel in vitro binding system, for a role of the PII-like SbtB protein in regulating Ci uptake by the bicarbonate transporter, SbtA, in response to the cellular adenylate energy charge (AEC) through dynamic protein-protein interaction. Binding of the SbtA and SbtB proteins from two phylogenetically distant species, Cyanobium sp . PCC7001 and Synechococcus elongatus PCC7942, was inhibited by high ATP, and promoted by low [ATP]:[ADP or AMP] ratios in vitro , consistent with a sensory response to the AEC mediated through adenylnucleotide ligand-specific conformation changes in SbtB. In vivo , cell cultures of S. elongatus showed up to 70% SbtB-dependent down-regulation of SbtA bicarbonate uptake activity specifically in the light activation phase during transitions from dark to low light when low cellular AEC is expected to limit metabolic activity. This suggests SbtB may function as a curfew protein during prolonged low cellular AEC and photosynthetically unfavourable conditions to prevent energetically futile and physiologically disadvantageous activation of SbtA.

Protein language models (PLMs) convert amino acid sequences into the numerical representations required to train machine learning (ML) models. Many PLMs are large (>600 M parameters) and trained on a broad span of protein sequence space. However, these models have limitations in terms of predictive accuracy and computational cost. Here, we use multiplexed Ancestral Sequence Reconstruction (mASR) to generate small but focused functional protein sequence datasets for PLM training. Compared to large PLMs, this local ancestral sequence embedding (LASE) produces representations 10-fold faster and with higher predictive accuracy. We show that due to the evolutionary nature of the ASR data, LASE produces smoother fitness landscapes in which protein variants that are closer in fitness value become numerically closer in representation space. This work contributes to the implementation of ML-based protein design in real-world settings, where data is sparse and computational resources are limited.

Abstract Much of the functional diversity observed in modern enzyme superfamilies originates from molecular tinkering with existing enzymes 1 . New enzymes frequently evolve from enzymes with latent, promiscuous activities 2 , and often inherit key features of the ancestral enzyme, retaining conserved catalytic groups and stabilizing analogous intermediates or transition states 3 . While experimental evolutionary biochemistry has yielded considerable insight into the evolution of new enzymes from existing enzymes 4 , the emergence of catalytic activity de novo remains poorly understood. Although certain enzymes are thought to have evolved from non-catalytic proteins 5–7 , the mechanisms underlying these complete evolutionary transitions have not been described. Here we show how the enzyme cyclohexadienyl dehydratase (CDT) evolved from a cationic amino acid-binding protein belonging to the solute-binding protein (SBP) superfamily. Analysis of the evolutionary trajectory between reconstructed ancestors and extant proteins showed that the emergence and optimization of catalytic activity involved several distinct processes. The emergence of CDT activity was potentiated by the incorporation of a desolvated general acid into the ancestral binding site, which provided an intrinsically reactive catalytic motif, and reshaping of the ancestral binding site, which facilitated enzyme-substrate complementarity. Catalytic activity was subsequently gained via the introduction of hydrogen-bonding networks that positioned the catalytic residue precisely and contributed to transition state stabilization. Finally, catalytic activity was enhanced by remote substitutions that refined the active site structure and reduced sampling of non-catalytic states. Our work shows that the evolutionary processes that underlie the emergence of enzymes by natural selection in the wild are mirrored by recent examples of computational design and directed evolution of enzymes in the laboratory.

Summary Evolution can lead to significantly distinct outcomes depending on the mutational path taken. Evolutionary bifurcation, in which two mutational trajectories segregate, becoming non-interchangeable over time, is the basis of diversification in all kingdoms of life. Here, we present a detailed molecular description of a bifurcation event that rapidly led to the emergence of two distinct enzymes from a common ancestor. When initiated from two starting points that differed by a single amino acid, the laboratory evolution of a phosphotriesterase (PTE) toward arylester hydrolysis resulted in different genetic and phenotypic outcomes. One trajectory led to a >35,000-fold increase in activity via the reorganization of its active site to achieve exquisite enzyme-substrate complementarity. The second trajectory gave rise to an evolved variant with a ∼500-fold increase in activity, but exhibiting an alternative substrate binding mode resulting from the destabilization of an active site loop. While initial mutations tend to dictate mutational accessibility, we rather observed the gradual divergence and specialisation of each trajectory, following the emergence of distinct molecular interaction networks. Intramolecular epistasis underlay pathway bifurcation by promoting unique synergistic interactions within each trajectory, while restricting the fixation of mutation across pathways. Our results illustrate how distinct molecular outcomes can radiate from a common protein ancestor and give rise to phenotypic diversity.

Several enzymes are known to have evolved from non-catalytic proteins such as solute-binding proteins (SBPs). Although attention has been focused on how a binding site can evolve to become catalytic, an equally important question is: how do the structural dynamics of a binding protein change as it becomes an efficient enzyme? Here we performed a variety of experiments, including double electron-electron resonance (DEER), on reconstructed evolutionary intermediates to determine how the conformational sampling of a protein changes along an evolutionary trajectory linking an arginine SBP to a cyclohexadienyl dehydratase (CDT). We observed that primitive dehydratases predominantly populate catalytically unproductive conformations that are vestiges of their ancestral SBP function. Non-productive conformational states are frozen out of the conformational landscape via remote mutations, eventually leading to extant CDT that exclusively samples catalytically relevant compact states. These results show that remote mutations can reshape the global conformational landscape of an enzyme as a mechanism for increasing catalytic activity.

ABSTRACT Periplasmic solute-binding proteins (SBPs) are key ligand recognition components of bacterial ATP-binding cassette (ABC) transporters that allow bacteria to import nutrients and metabolic precursors from the environment. Periplasmic SBPs comprise a large and diverse family of proteins, of which only a small number have been empirically characterized. In this work, we identify a set of 610 unique uncharacterized proteins within the SBP_bac_5 family that are found in conserved operons comprising genes encoding (i) ABC transport systems and (ii) putative amidases from the FmdA_AmdA family. From these uncharacterized SBP_bac_5 proteins, we characterize a representative periplasmic SBP from Mesorhizobium sp. A09 ( Me Ami_SBP) and show that Me Ami_SBP binds l -amino acid amides but not the corresponding l -amino acids. An X-ray crystal structure of Me Ami_SBP bound to l -serinamide highlights the residues that impart distinct specificity for l -amino acid amides and reveals a structural Ca 2+ binding site within one of the lobes of the protein. We show that the residues involved in ligand and Ca 2+ binding are conserved amongst the 610 SBPs from experimentally uncharacterized FmdA_AmdA amidase-associated ABC transporter systems, suggesting these homologous systems are also likely to be involved in the sensing, uptake and metabolism of l -amino acid amides across many Gram-negative nitrogen-fixing soil bacteria. We propose that Me Ami_SBP is involved in the uptake of such solutes to supplement pathways such as the citric acid cycle and the glutamine synthetase-glutamate synthase pathway. This work expands our currently limited understanding of microbial interactions with l -amino acid amides and bacterial nitrogen utilization.

Abstract The emergence of oligomers is common during the evolution and diversification of protein families, yet the selective advantage of oligomerization is often cryptic or unclear. Oligomerization can involve the formation of isologous head-to-head interfaces (e.g., in symmetrical dimers) or heterologous head-to-tail interfaces (e.g., in cyclic complexes), the latter of which is less well studied and understood. In this work, we retrace the emergence of the trimeric form of cyclohexadienyl dehydratase from Pseudomonas aeruginosa (PaCDT) by introducing residues that form the PaCDT trimer-interface into AncCDT-5 (a monomeric reconstructed ancestor of PaCDT). We find that single interface mutations can switch the oligomeric state of the variants (implying evolutionarily metastable oligomeric states) and that trimerization corresponds with a reduction in the K M value of the enzyme from a promiscuous level to the physiologically relevant range. We show that this can be rationalized at the structural and dynamic level by reduced sampling of a non-catalytic conformational substate, and that trimerization was likely followed by a C-terminal extension that further refined the conformational sampling and kinetic properties of the enzyme. This work provides insight into how neutral sampling of metastable oligomeric states along an evolutionary trajectory can facilitate the evolution and optimization of enzyme function. Importance & Impact Statement Understanding how and why structural complexity (including homo-oligomerization and sequence insertions) emerges during the evolution and diversification of natural enzymes is a key goal in the study and design of protein function. We show that cyclic homo-oligomeric states can emerge via a small number of substitutions, and that trimerization and a C-terminal extension contributed to the tuning of catalytic properties during the evolution of cyclohexadienyl dehydratase from Pseudomonas aeruginosa .

Antibodies targeting the NANP/NVDP repeat domain of the Plasmodium falciparum circumsporozoite protein (CSPRepeat) can confer protection against malaria. However, it has also been suggested that this repeat domain exists as a decoy that distracts the immune system from mounting protective responses targeting other domains of CSP. Here we show that B cell responses to the repeat domain are indeed ~10 fold higher than responses to the N- and C- terminal regions of CSP after sporozoite immunization. We investigated the role of the number of CSPRepeat-specific naive precursor B cells and high avidity binding by B cells in driving the immunodominance of the CSPRepeat. Using adoptive transfer of germline precursors specific for the CSPRepeat, we found that increasing precursor number did indeed increase the responses to the repeat region, but not to the detriment of responses to other epitopes. To investigate the role of avid binding by B cells to the CSPRepeat in driving immunodominance we generated CSP9: a truncated CSP molecule with just 9 NANP repeats. Compared to near full length CSP molecules, CSP9 induced lower BCR signalling in CSPRepeat-specific cells and induced stronger responses to non-repeat epitopes. Finally, we found mice immunized with CSP9 molecules were strongly protected against mosquito bite challenge. Collectively these data demonstrate that the CSPRepeat does function as an immunodominant decoy and that truncated CSP molecules may be a promising avenue for future malaria vaccines.

The repeat region of the Plasmodium falciparum circumsporozoite protein (CSP) is a major vaccine antigen because it can be targeted by parasite neutralizing antibodies; however, little is known about this interaction. We used isothermal titration calorimetry, X-ray crystallography and mutagenesis-validated modeling to analyze the binding of a murine neutralizing antibody to Plasmodium falciparum CSP. Strikingly, we found that the repeat region of CSP is bound by multiple antibodies. This repeating pattern allows multiple weak interactions of single FAB domains to accumulate and yield a complex with a dissociation constant in the low nM range. Because the CSP protein can potentially cross-link multiple B cell receptors (BCRs) we hypothesized that the B cell response might be T cell independent. However, while there was a modest response in mice deficient in T cell help, the bulk of the response was T cell dependent. By sequencing the BCRs of CSP-repeat specific B cells in inbred mice we found that these cells underwent somatic hypermutation and affinity maturation indicative of a T-dependent response. Last, we found that the BCR repertoire of responding B cells was limited suggesting that the structural simplicity of the repeat may limit the breadth of the immune response.

Cyanobacteria have evolved a suite of enzymes and inorganic carbon (Ci) transporters that improve photosynthetic performance by increasing the localized concentration of CO2 around the primary CO2-fixating enzyme, Rubisco. This CO2-concentrating mechanism (CCM) is highly regulated, responds to illumination/darkness cycles and allows cyanobacteria to thrive under limiting Ci conditions. While the transcriptional control of CCM activity is well understood, less is known about how regulatory proteins might allosterically regulate Ci transporters in response to changing conditions. Cyanobacterial sodium-dependent bicarbonate transporters (SbtAs) are inhibited by PII-like regulatory proteins (SbtBs), with the inhibitory effect being modulated by adenylnucleotides. Here, we used isothermal titration calorimetry to show that SbtB from Cyanobium sp. PCC7001 (SbtB7001) binds AMP, ADP, cAMP and ATP with micromolar-range affinities. X-ray crystal structures of apo- and nucleotide-bound SbtB7001 revealed that while AMP, ADP and cAMP have little effect on the SbtB7001 structure, binding of ATP stabilizes the otherwise flexible T-loop and that the flexible C-terminal C-loop adopts several distinct conformations. We also show that ATP binding affinity is increased ten-fold in the presence of Ca2+ and we present an X ray crystal structure of Ca2+ATP:SbtB7001 that shows how this metal ion facilitates additional stabilizing interactions with the apex of the T-loop. We propose that the Ca2+ATP-induced conformational change observed in SbtB7001 is important for allosteric regulation of SbtA activity by SbtB and is consistent with changing adenylnucleotide levels in illumination/darkness cycles.