Small, compact genomes of ultrasmall unicellular algae provide information on the basic and essential genes that support the lives of photosynthetic eukaryotes, including higher plants1,2. Here we report the 16,520,305-base-pair sequence of the 20 chromosomes of the unicellular red alga Cyanidioschyzon merolae 10D as the first complete algal genome. We identified 5,331 genes in total, of which at least 86.3% were expressed. Unique characteristics of this genomic structure include: a lack of introns in all but 26 genes; only three copies of ribosomal DNA units that maintain the nucleolus; and two dynamin genes that are involved only in the division of mitochondria and plastids. The conserved mosaic origin of Calvin cycle enzymes in this red alga and in green plants supports the hypothesis of the existence of single primary plastid endosymbiosis. The lack of a myosin gene, in addition to the unexpressed actin gene, suggests a simpler system of cytokinesis. These results indicate that the C. merolae genome provides a model system with a simple gene composition for studying the origin, evolution and fundamental mechanisms of eukaryotic cells.

Abstract Mitochondrial biogenesis relies on hundreds of proteins which are derived from genes encoded in the nucleus. According to characteristic properties of N-terminal targeting peptides (TP) and multi-step authentication by the protein translocase called the TOM complex, nascent polypeptides satisfying the requirements are imported into mitochondria. However, it has not been investigated whether the eukaryotic cell with a simple proteome and a single mitochondrion in a cell has a similar or simpler complexity of presequence requirements for mitochondrial protein import as other eukaryotes with multiple mitochondria. Based on the amino acid compositions of putative mitochondrial TP sequences in the unicellular red alga Cyanidioschyzon merolae , we designed the synthetic TP (synTP) and confirmed that synTP-fused mVenus were translocated into the mitochondrion in vivo . Through a series of experimental evaluations using modified synTPs, we showed that functional TP must have some basic residues, at least one, and compose the specific amino acid composition, but the physicochemical properties of net charge, hydrophobicity and hydrophobic moment are not strictly determined in C. merolae . Combined with the simple composition of the TOM complex in C. merolae , our results suggest that a regional positive charge in TP would be recognized and verified solely by TOM22 as a single-step authentication for mitochondrial protein import in C. merolae . The simple authentication mechanism indicates that the C. merolae cell, with its simple cell structure and genome, would not need to increase the cryptographic complexity of the lock-and-key for mitochondrial protein import.

Abstract The simple cellular structure of the unicellular alga Cyanidioschyzon merolae consists of one nucleus, one mitochondrion, one chloroplast, and one peroxisome per cell and offers unique advantages to investigate mechanisms of organellar proliferation and the cell cycle. Here, we describe an engineered clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) system, CZON-cutter, for simultaneous genome editing and organellar visualization. We engineered a C. merolae strain expressing a nuclear-localized Cas9-Venus nuclease to target editing at a locus defined by a single-guide RNA (sgRNA). We then successfully edited the algal genome and visualized the mitochondrion and peroxisome in transformants by fluorescent protein reporters with different excitation wavelengths. Fluorescent protein labeling of organelles in living transformants allows validation of phenotypes associated with organellar proliferation and the cell cycle, even when the edited gene is essential. Combined with the exceptional biological features of C. merolae , CZON-cutter will be instrumental for investigating cellular and organellar division in a high-throughput manner. Summary An engineered CRISPR-Cas9 system, named CZON-cutter, for simultaneous genome editing and fluorescent protein labeling of organelles in Cyanidioschyzon merolae can be used to validate intracellular function of a particular gene, even if it is essential.

Cell proliferation is a fundamental characteristic of organisms, driven by the holistic functions of multiple proteins encoded in the genome. However, the individual contributions of thousands of genes and the millions of protein molecules they express to cell proliferation are still not fully understood, even in simple eukaryotes. Here, we present a genome-wide translation map of cells during proliferation in the unicellular alga Cyanidioschyzon merolae, based on the sequencing of ribosome-protected messenger RNA fragments. Ribosome profiling has revealed both qualitative and quantitative changes in protein translation for each gene during cell division, driven by the large-scale reallocation of ribosomes. Comparisons of ribosome footprints from non-dividing and dividing cells allowed the identification of proteins involved in cell proliferation. Given that in vivo experiments on two selected candidate proteins identified a division-phase-specific mitochondrial nucleoid protein and a mitochondrial division protein, further analysis of the candidate proteins may offer key insights into the comprehensive mechanism that facilitate cell and organelle proliferation.