Transcription regulation occurs frequently through promoter-associated pausing of RNA polymerase II (Pol II). We developed a precision nuclear run-on and sequencing (PRO-seq) assay to map the genome-wide distribution of transcriptionally engaged Pol II at base pair resolution. Pol II accumulates immediately downstream of promoters, at intron-exon junctions that are efficiently used for splicing, and over 3' polyadenylation sites. Focused analyses of promoters reveal that pausing is not fixed relative to initiation sites, nor is it specified directly by the position of a particular core promoter element or the first nucleosome. Core promoter elements function beyond initiation, and when optimally positioned they act collectively to dictate the position and strength of pausing. This "complex interaction" model was tested with insertional mutagenesis of the Drosophila Hsp70 core promoter.

Production of mRNA depends critically on the rate of RNA polymerase II (Pol II) elongation. To dissect Pol II dynamics in mouse ES cells, we inhibited Pol II transcription at either initiation or promoter-proximal pause escape with Triptolide or Flavopiridol, and tracked Pol II kinetically using GRO-seq. Both inhibitors block transcription of more than 95% of genes, showing that pause escape, like initiation, is a ubiquitous and crucial step within the transcription cycle. Moreover, paused Pol II is relatively stable, as evidenced from half-life measurements at ∼3200 genes. Finally, tracking the progression of Pol II after drug treatment establishes Pol II elongation rates at over 1000 genes. Notably, Pol II accelerates dramatically while transcribing through genes, but slows at exons. Furthermore, intergenic variance in elongation rates is substantial, and is influenced by a positive effect of H3K79me2 and negative effects of exon density and CG content within genes.

N6-methyladenosine (m6A) is the most prevalent modified nucleotide in mRNA1,2, with around 25% of mRNAs containing at least one m6A. Methylation of mRNA to form m6A is required for diverse cellular and physiological processes3. Although the presence of m6A in an mRNA can affect its fate in different ways, it is unclear how m6A directs this process and why the effects of m6A can vary in different cellular contexts. Here we show that the cytosolic m6A-binding proteins—YTHDF1, YTHDF2 and YTHDF3—undergo liquid–liquid phase separation in vitro and in cells. This phase separation is markedly enhanced by mRNAs that contain multiple, but not single, m6A residues. Polymethylated mRNAs act as a multivalent scaffold for the binding of YTHDF proteins, juxtaposing their low-complexity domains and thereby leading to phase separation. The resulting mRNA–YTHDF complexes then partition into different endogenous phase-separated compartments, such as P-bodies, stress granules or neuronal RNA granules. m6A-mRNA is subject to compartment-specific regulation, including a reduction in the stability and translation of mRNA. These studies reveal that the number and distribution of m6A sites in cellular mRNAs can regulate and influence the composition of the phase-separated transcriptome, and suggest that the cellular properties of m6A-modified mRNAs are governed by liquid–liquid phase separation principles. The cytosolic N6-methyladenosine (m6A)-binding proteins YTHDF1, YTHDF2 and YTHDF3 undergo liquid–liquid phase separation in vitro and in cells; this is enhanced by polymethylated mRNAs to form complexes that partition into different cellular phase-separated compartments.

Mahat et al. describe how to map the genome-wide positions of active RNA polymerases using a modified nuclear run-on approach called PRO-seq. Details for PRO-cap, a modification that identifies transcription start sites, are also included. We provide a protocol for precision nuclear run-on sequencing (PRO-seq) and its variant, PRO-cap, which map the location of active RNA polymerases (PRO-seq) or transcription start sites (TSSs) (PRO-cap) genome-wide at high resolution. The density of RNA polymerases at a particular genomic locus directly reflects the level of nascent transcription at that region. Nuclei are isolated from cells and, under nuclear run-on conditions, transcriptionally engaged RNA polymerases incorporate one or, at most, a few biotin-labeled nucleotide triphosphates (biotin-NTPs) into the 3′ end of nascent RNA. The biotin-labeled nascent RNA is used to prepare sequencing libraries, which are sequenced from the 3′ end to provide high-resolution positional information for the RNA polymerases. PRO-seq provides much higher sensitivity than ChIP-seq, and it generates a much larger fraction of usable sequence reads than ChIP-seq or NET-seq (native elongating transcript sequencing). Similarly to NET-seq, PRO-seq maps the RNA polymerase at up to base-pair resolution with strand specificity, but unlike NET-seq it does not require immunoprecipitation. With the protocol provided here, PRO-seq (or PRO-cap) libraries for high-throughput sequencing can be generated in 4–5 working days. The method has been applied to human, mouse, Drosophila melanogaster and Caenorhabditis elegans cells and, with slight modifications, to yeast.

Recent genome-wide studies in metazoans have shown that RNA polymerase II (Pol II) accumulates to high densities on many promoters at a rate-limited step in transcription. However, the status of this Pol II remains an area of debate. Here, we compare quantitative outputs of a global run-on sequencing assay and chromatin immunoprecipitation sequencing assays and demonstrate that the majority of the Pol II on Drosophila promoters is transcriptionally engaged; very little exists in a preinitiation or arrested complex. These promoter-proximal polymerases are inhibited from further elongation by detergent-sensitive factors, and knockdown of negative elongation factor, NELF, reduces their levels. These results not only solidify the notion that pausing occurs at most promoters, but demonstrate that it is the major rate-limiting step in early transcription at these promoters. Finally, the divergent elongation complexes seen at mammalian promoters are far less prevalent in Drosophila, and this specificity in orientation correlates with directional core promoter elements, which are abundant in Drosophila.

Cancer cells often heterogeneously respond to genotoxic chemotherapy, leading to fractional killing and chemoresistance, which remain as the major obstacles in cancer treatment. It is widely believed that DNA damage induces a uniform response in regulating transcription and that cell fate is passively determined by a threshold mechanism evaluating the level of transcriptional responses. On the contrary to this assumption, here we show that a surprisingly high level of heterogeneity exists in individual cell transcriptome responses to DNA damage, and that these transcriptome variations dictate the cell fate after DNA damage. Many DNA damage response genes, including tumor suppressor p53 targets, were exclusively expressed in only a subset of cells having specific cell fate, producing unique stress responses tailored for the fate that the cells are committed to. For instance, CDKN1A, the best known p53 target inhibiting cell cycle, was specifically expressed in a subset of cells undergoing cell cycle checkpoint, while other pro-apoptotic p53 targets were expressed only in cells undergoing apoptosis. A small group of cells exhibited neither checkpoint nor apoptotic responses, but produced a unique transcriptional program that conferred strong chemoresistance to the cells. The heterogeneous transcriptome response to DNA damage was also observed at the protein level in flow cytometry. Our results demonstrate that cell fate heterogeneity after DNA damage is mediated by distinct transcriptional programs generating fate-specific gene expression landscapes. This finding provides an important insight into understanding heterogeneous chemotherapy responses of cancer cells.

The human genome encodes a variety of poorly understood RNA species that remain challenging to identify using existing genomic tools. We developed chromatin run-on and sequencing (ChRO-seq) to map the location of RNA polymerase using virtually any input sample, including samples with degraded RNA that are intractable to conventional RNA-seq. We used ChRO-seq to develop the first maps of nascent transcription in primary human glioblastoma (GBM) brain tumors. Whereas enhancers discovered in primary GBMs resemble open chromatin in the normal human brain, rare enhancers activated in malignant tissue drive regulatory programs similar to the developing nervous system. We identified enhancers that regulate genes characteristic of each known GBM subtype, identified transcription factors that drive them, and discovered a core group of transcription factors that control the expression of genes associated with clinical outcomes. This study uncovers new insights into the molecular etiology of GBM and introduces ChRO-seq which can now be used to map regulatory programs contributing to a variety of complex diseases.

Enhancer RNAs (eRNA) are non-coding RNAs transcribed bidirectionally from active regulatory sequences. Their expression levels correlate with the activating potentials of the enhancers, but due to their instability, eRNAs have proven difficult to quantify in large scale. To overcome this, we use capped-nascent-RNA sequencing to efficiently capture the bidirectional initiation of eRNAs. We apply this in large scale to the human lymphoblastoid cell lines from the Yoruban population, and detected nearly 75,000 eRNA transcription sites with high sensitivity and specificity. We identify genetic variants significantly associated with overall eRNA initiation levels, as well as the transcription directionality between the two divergent eRNA pairs, namely the transcription initiation and directional initiation quantitative trait loci (tiQTLs and diQTLs) respectively. High-resolution analyses of these two types of eRNA QTLs reveal distinct positions of enrichment not only at the central transcription factor (TF) binding regions but also at the flanking eRNA initiation regions, both of which are equivalently associated with mRNA expression QTLs. These two regions - the central TF binding footprint and the eRNA initiation cores - define the bipartite architecture and the function of enhancers, and may provide further insights into interpreting the significance of non-coding regulatory variants.

Summary Positive strand, single strand RNA viruses ((+)ssRNA viruses) are viruses with an RNA genome that have broad impacts on a wide range of hosts, including SARS-CoV-2 human respiratory infections. Their replication and gene expression are driven by RNA dependent RNA polymerases (RdRp). Detecting active RNA synthesis by RdRp is critical for assessing the infectivity and pathogenicity of (+)ssRNA viruses. Current approaches rely on viral RNA detection, which cannot distinguish viral titer from RdRp activity. Precision Run-On sequencing (PRO-seq) is a nuclear run-on based nascent RNA sequencing method, widely used to map eukaryotic RNA polymerases by using labeled nucleotide analogues. Here we provide evidence that PRO-seq also detects RdRp activity and can serve as a highly sensitive RdRp mapping method. Coupled to PRO-seq in human blood samples, we propose to use PRO-seq as a single package method to detect (+)ssRNA virus RdRp activity and its interaction with host immune response through transcriptome-wide profiling of leukocyte gene expressions at once.