ABSTRACT We compared four orthogonal technologies for sizing, counting, and phenotyping of extracellular vesicles (EVs) and synthetic particles. The platforms were: single-particle interferometric reflectance imaging sensing (SP-IRIS) with fluorescence, nanoparticle tracking analysis (NTA) with fluorescence, microfluidic resistive pulse sensing (MRPS), and nanoflow cytometry measurement (NFCM). EVs from the human T lymphocyte line H9 (high CD81, low CD63) and the promonocytic line U937 (low CD81, high CD63) were separated from culture conditioned medium (CCM) by differential ultracentrifugation (dUC) or a combination of ultrafiltration (UF) and size exclusion chromatography (SEC) and characterized by transmission electron microscopy (TEM) and Western blot (WB). Mixtures of synthetic particles (silica and polystyrene spheres) with known sizes and/or concentrations were also tested. MRPS and NFCM returned similar particle counts, while NTA detected counts approximately one order of magnitude lower for EVs, but not for synthetic particles. SP-IRIS events could not be used to estimate particle concentrations. For sizing, SP-IRIS, MRPS, and NFCM returned similar size profiles, with smaller sizes predominating (per power law distribution), but with sensitivity typically dropping off below diameters of 60 nm. NTA detected a population of particles with a mode diameter greater than 100 nm. Additionally, SP-IRIS, MRPS, and NFCM were able to identify at least three of four distinct size populations in a mixture of silica or polystyrene nanoparticles. Finally, for tetraspanin phenotyping, the SP-IRIS platform in fluorescence mode was able to detect at least two markers on the same particle, while NFCM detected either CD81 or CD63. Based on the results of this study, we can draw conclusions about existing single-particle analysis capabilities that may be useful for EV biomarker development and mechanistic studies.

Abstract Interest in using nanoparticles for delivery of therapeutic RNA has been steadily growing, provoking a need to precisely understand their structure and contents. Single-particle and single-molecule analysis techniques provide snapshots of single biological nanoparticles, including viruses, liposomes, and extracellular vesicles (EVs). While existing methods primarily focus on protein detection, RNA delivery is becoming increasingly prevalent. A method to simultaneously detect protein and internal RNA in the same particle would reveal variability in size, structure, and RNA packaging efficiency, enabling optimization of nanoparticle delivery. Here, we introduce SPIRFISH, a high-throughput method for single-particle protein and RNA analysis, combining single particle interferometric reflectance imaging sensor (SP-IRIS) with single-molecule fluorescence in-situ hybridization (smFISH). Using SPIRFISH, we detect HIV-1 envelope protein and genomic RNA within single infectious virions, allowing resolution against EV background and noninfectious virions. We further show that SPIRFISH can be used to detect specific RNA within EVs. SPIRFISH should enable single particle analysis of a broad class of RNA-containing nanoparticles. Teaser: A new single particle analysis technique simultaneously detects specific RNA and protein in biological nanoparticles.

Thyroid cancer is the most prevalent malignancy of the endocrine system. We and others have shown that several microRNAs, which are post-transcriptional gene regulators, are aberrantly expressed in anaplastic thyroid cancer (ATC) and papillary thyroid cancer (PTC) tissues, as well as cell lines derived from these cancers. In the cell, miRNAs are bound to Argonaute (AGO) proteins as what could be termed low molecular weight RNA-Induced Silencing Complexes (LMW-RISCs) that can then assemble with additional proteins, mRNA, and translation machinery into high molecular weight RISCs (HMW-RISCs) that also exert regulatory function. In this study, we sought to analyze the association of miRNAs with RISC complexes in ATC and PTC. For ATC and PTC lines, miRNA species were enriched in both HMW-RISC and LMW-RISC cellular fractions, compared with intermediate molecular weight fractions and very low molecular weight (AGO-poor) fractions. Furthermore, 60% of all miRNAs were slightly more abundant in LMW-RISC versus HMW-RISC fractions by ∼2-4 fold. Surprisingly, miR-21-5p, one of the most abundant miRNAs in both ATC and PTC lines and one of the most widely studied oncogenic miRNAs in many solid tumors, was consistently one the least abundant miRNAs in HMW-RISC and the most enriched miRNA in LMW-RISC fractions. These findings may suggest that miR-21 has a role or roles distinct from canonical posttranscriptional regulation in cancer. Furthermore, the methodology described here is a useful way to assess the distribution of miR-21 between HMW and LMW-RISCs and may help to reveal the true roles of this miRNA in thyroid cancer development, progression, and treatment.

The goal of this study was to characterize extracellular vesicles (EVs) and miRNAs of primate cervicovaginal lavage (CVL) during the menstrual cycle and simian immunodeficiency virus (SIV) infection, and to determine if differentially regulated CVL miRNAs might influence retrovirus replication. CVL and peripheral blood were collected from SIV-infected and uninfected macaques. EVs were enriched by stepped ultracentrifugation and characterized thoroughly. miRNA profiles were assessed with a medium-throughput stem-loop/hydrolysis probe qPCR platform and validated by single qPCR assays. Hormone cycling was abnormal in infected subjects, but EV concentration correlated with progesterone concentration in uninfected subjects. miRNAs were present predominantly in the EV-depleted CVL supernatant. Only a small number of CVL miRNAs were found to vary during the menstrual cycle or SIV infection. Among them was miR-186-5p, which was depleted in retroviral infection. In experiments with infected macrophages in vitro, this miRNA inhibited HIV replication. These results provide further evidence for the potential of EVs and small RNAs as biomarkers or effectors of disease processes in the reproductive tract.

Extracellular vesicles (EVs, including exosomes and microvesicles) are involved in intercellular communication in health and disease and affect processes including immune and antiviral responses. Ultracentrifuged serum is depleted of EVs and, when used in culture media, reduces growth and viability of some cell types. In this study, we examined the effects of serum EV depletion processes on HIV-1 replication in primary cells and cell lines, including two HIV-1 latency models. Increased HIV-1 production was observed in certain EV-depleted conditions, along with cell morphology changes and decreased cell viability. Add-back of ultracentrifuge pellets rescued baseline HIV-1 production. Primary cells appeared to be less sensitive to EV depletion. ACH-2 and U1 latency models produced more HIV-1 under EV-depleted conditions, while virus produced under processed serum conditions was more infectious. Finally, changes in cellular metabolism and gene expression were associated with EV-depleted culture. In conclusion, the EV environment of HIV-1 infected cells has a substantial effect on virus production and infectivity. EV-dependence of cell cultures should be examined carefully along with other experimental variables. However, EVs may not be the only particles depleted by ultracentrifugation or other processes. Effects of EVs may be accompanied by or confused with those of closely associated or physically similar particles.

ABSTRACT Objectives Latent infection by human immunodeficiency virus (HIV) hinders viral eradication despite effective antiretroviral treatment (ART), Amongst proposed contributors to viral latency are cellular small RNAs that have also been proposed to shuttle between cells in extracellular vesicles (EVs). Thus, we profiled EV small RNAs during different infection phases to understand the potential relationship between these EV-associated small RNAs and viral infection. Design A well characterized simian immunodeficiency virus (SIV)/macaque model of HIV was used to profile EV-enriched blood plasma fractions harvested during pre-infection, acute infection, latent infection/ART treatment, and rebound after ART interruption. Methods Measurement of EV concentration, size distribution, and morphology was complemented with qPCR array for small RNA expression, followed by individual qPCR validations. Iodixanol density gradients were used to separate EV subtypes and virions. Results Plasma EV particle counts correlated with viral load and peaked during acute infection. However, SIV gag RNA detection showed that virions did not fully explain this peak. EV microRNAs miR-181a, miR-342-3p, and miR-29a decreased with SIV infection and remained downregulated in latency. Interestingly, small nuclear RNA U6 had a tight association with viral load peak. Conclusions This study is the first to monitor how EV concentration and EV small RNA expression change dynamically in acute viral infection, latency, and rebound in a carefully controlled animal model. These changes may also reveal regulatory roles in retroviral infection and latency.