Abstract Rocaglamide has been reported to sensitize several cell types to TRAIL-induced apoptosis. In recent years, advances in synthetic techniques have led to generation of novel rocaglamide analogs. However, these have not been extensively analyzed as TRAIL sensitizers, particularly in TRAIL-resistant renal cell carcinoma cells. Evaluation of rocaglamide and analogs identified 29 compounds that are able to sensitize TRAIL-resistant ACHN cells to TRAIL-induced, caspase-dependent apoptosis with sub-µM potency which correlated with their potency as protein synthesis inhibitors and with loss of cFLIP protein in the same cells. Rocaglamide alone induced cell cycle arrest, but not apoptosis. Rocaglates averaged 4–5-fold higher potency as TRAIL sensitizers than as protein synthesis inhibitors suggesting a potential window for maximizing TRAIL sensitization while minimizing effects of general protein synthesis inhibition. A wide range of other rocaglate effects ( e . g . on JNK or RAF-MEK-ERK signaling, death receptor levels, ROS, ER stress, eIF4E phosphorylation) were assessed, but did not contribute to TRAIL sensitization. Other than a rapid loss of MCL-1, rocaglates had minimal effects on mitochondrial apoptotic pathway proteins. The identification of structurally diverse/mechanistically similar TRAIL sensitizing rocaglates provides insights into both rocaglate structure and function and potential further development for use in RCC-directed combination therapy.

Abstract Uncompetitive inhibition is an effective strategy for suppressing dysregulated enzymes and their substrates, but discovery of suitable ligands depends on often-unavailable structural knowledge and serendipity. Hence, despite surging interest in mass spectrometry-based target identification, proteomic studies of substrate-dependent target engagement remain sparse. Herein, we describe the Thermal Shift Assay with ATP and RNA (TSAR) as a template for proteome-wide discovery of substrate-dependent ligand binding. Using proteomic thermal shift assays, we show that simple biochemical additives can facilitate detection of target engagement in native cell lysates. We apply our approach to rocaglates, a family of molecules that specifically clamp RNA to eukaryotic translation initiation factor 4A (eIF4A), DEAD-box helicase 3X (DDX3X), and potentially other members of the DEAD-box (DDX) family of RNA helicases. To identify unexpected interactions, we optimized a target class-specific thermal denaturation window and evaluated ATP analog and RNA probe dependencies for key rocaglate-DDX interactions. We report novel DDX targets of the rocaglate clamping spectrum, confirm that DDX3X is a common target of several widely studied analogs, and provide structural insights into divergent DDX3X affinities between synthetic rocaglates. We independently validate novel targets of high-profile rocaglates, including the clinical candidate Zotatifin ( eFT226 ), using limited proteolysis-mass spectrometry and fluorescence polarization experiments. Taken together, our study provides a model for screening uncompetitive inhibitors using a systematic chemical-proteomics approach to uncover actionable DDX targets, clearing a path towards characterization of novel molecular clamps and associated RNA helicase targets.

SUMMARY To develop into the central nervous system, neuroepithelial cells must first form a neural tube consisting of a series of patterned neural progenitor cells along the anterior-posterior (AP) axis. Based on studies using model organisms, it has been revealed that AP spatial regionalization is dominated by gradients of morphogens that regulate retinoic acid (RA), sonic hedgehog (SHH), bone morphogenetic proteins (BMPs), and Wingless/int1 (WNT) signaling pathways. Recently, human pluripotent stem cells (hPSCs) were successfully induced into a patterned neural tissue with differential AP gene expression levels by a gradient of WNT activity controlled by a microfluidic device. However, the midbrain and hindbrain boundaries were not as sharp as observed in vivo, likely due to the lack of additional important morphogenic factors, such as RA and SHH. Here, we induced micropatterned hPSCs into AP patterned neural tissue by activating not only WNT but also RA and SHH signals under fully defined culture conditions. We found that hPSCs self-organized into spatially patterned midbrain (FOXG1 - OTX2 + ) and hindbrain (HOXB4 + ) progenitors with a sharp boundary after 6 days of induction. Following the initial induction, the cells with midbrain identities near the pattern boundary folded inwardly to form a 3D structure, maintaining a distinct boundary between OTX2 + and HOXB4 + zones. To investigate the mechanism of cell fates patterning, we found that the reaction-diffusion of BMP/Noggin played a role in AP regionalization, while differential mechanical stress and cell sorting were unlikely to be involved. Then, we validated our model by investigating the effects of exposure to two known teratogens including valproic acid and isotretinoin. Drug treatment results successfully predicted that valproic acid inhibited the development of both midbrain and hindbrain development while isotretinoin disrupts the normal AP patterning of the midbrain and hindbrain. In conclusion, by integrating engineering approaches and chemically defined culture conditions, we have developed an in vitro AP patterned model of early human midbrain and hindbrain development, and we have revealed its potential to be employed as a high throughput drug discovery system.

The increasing problem of infectious diseases caused by antibiotic-resistant bacteria has intensified a search for novel host-directed therapies aimed at either boosting immune-mediated bacterial control or reducing immunopathology. Macrophages play central roles in eliminating pathogens as well as in tissue homeostasis and repair via alternative activation programs, M1-like and M2-like, respectively. Macrophages of both phenotypes are often present at the sites of chronic unresolved inflammation, such infectious granulomas and solid tumors, where the M2-like macrophages generate microenvironment conducive for pathogen survival or tumor progression. Interferon-gamma is a major cytokine that drives M1-like macrophage activation, which is essential for control of intracellular bacterial pathogens. To evaluate M1-like macrophage polarization as a broad therapeutic strategy, we searched for small molecules capable of enhancing effects of low concentrations of IFNγ on M1 macrophage polarization. We identified synthetic rocaglates that potentiated macrophages responses to low concentrations of IFNγ. Although known as potent translation inhibitors in tumor cell lines, in primary macrophages select rocaglates induced the upregulation of IRF1, a master regulator of IFNγ-activated pathways, stimulated autophagy and increased macrophage resilience to oxidative stress. In contrast, rocaglates inhibited macrophage responsiveness to IL-4, a prototypical activator of the M2-like phenotype. The M1-like macrophage programing by rocaglates was mechanistically linked to selective translation inhibition and modulation of MAP kinase network. Thus, rocaglates represent a novel class of immunomodulators that can enforce macrophage polarization towards the M1-like phenotype in complex microenvironments associated with hypofunction of type 1 and/or hyperactivation of type 2 immunity, e.g., chronic bacterial infections, allergies and, possibly, certain tumors.

ABSTRACT It has been found that many types of cells form nematic symmetry on confined planar substrates. Such observation has been satisfactorily explained by modeling cells as crowded self-propelled rods. In this work, we report that rat embryonic fibroblast (REF) cells when confined in circular mesoscale patterns, form a new type of symmetry where cells align radially at the boundary. Unlike NIH-3T3 and MDCK monolayers, the REF monolayer presents a supracellular actin gradient with isotropic meshwork. In addition, the contractile REF cells present strong adhesive interactions with neighboring cells, which confers the monolayer with significant condensation tendency. We found the loss of condensation tendency by inhibiting the cell contractility or disrupting cell-cell adhesion led to the disappearance of the radial alignment. In theory, we found the prestretch due to condensation tendency with differential cell stiffness is sufficient to explain the new symmetry within a confined tissue continuum.

A central challenge in chemical biology is to distinguish molecular families in which small structural changes trigger large changes in cell biology. Such families might be ideal scaffolds for developing cell-selective chemical effectors - for example, molecules that activate DNA damage responses in malignant cells while sparing healthy cells. Across closely related structural variants, subtle structural changes have the potential to result in contrasting bioactivity patterns across different cell types. Here, we tested a 600-compound Diversity Set of screening molecules from the Boston University Center for Molecular Discovery (BU-CMD) in a novel phospho-flow assay that tracked fundamental cell biological processes, including DNA damage response, apoptosis, M-phase cell cycle, and protein synthesis in MV411 leukemia cells. Among the chemotypes screened, synthetic congeners of the rocaglate family were especially bioactive. In follow-up studies, 37 rocaglates were selected and deeply characterized using 12 million additional cellular measurements across MV411 leukemia cells and healthy peripheral blood mononuclear cells. Of the selected rocaglates, 92% displayed significant bioactivity in human cells, and 65% selectively induced DNA damage responses in leukemia and not healthy human blood cells. Furthermore, the signaling and cell-type selectivity were connected to structural features of rocaglate subfamilies. In particular, three rocaglates from the rocaglate pyrimidinone (RP) structural subclass were the only molecules that activated exceptional DNA damage responses in leukemia cells without activating a detectable DNA damage response in healthy cells. These results indicate that the RP subset should be extensively characterized for anticancer therapeutic potential as it relates to the DNA damage response. This single cell profiling approach advances a chemical biology platform to dissect how systematic variations in chemical structure can profoundly and differentially impact basic functions of healthy and diseased cells.

Abstract Cancer-associated fibroblasts (CAFs) give rise to desmoplastic stroma, which supports tumor progression and metastasis, and comprises up to 90% of the tumor mass in pancreatic cancer. Recent work by us and others has shown that CAFs are transcriptionally rewired by adjacent cancer cells to form heterogeneous subtypes. Whether this rewiring is differentially affected by different driver mutations in cancer cells is largely unknown. Here we address this question by dissecting and comparing the stromal landscape of BRCA -mutated and BRCA Wild-type (WT) pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC). We comprehensively analyze PDAC samples from a cohort of 42 patients by laser-capture microdissection, RNA-sequencing and multiplexed immunofluorescence, revealing different CAF subtype compositions in germline BRCA -mutated vs. BRCA -WT tumors. In particular, we detect an increase in a subset of Clusterin (CLU)-positive CAFs in BRCA -mutated tumors. We further unravel a network of stress responses upregulated in BRCA -mutated tumors. Using cancer organoids and cell co-cultures, we show that the transcriptional shift of pancreatic stellate cells into CLU + CAFs is mediated through activation of heat-shock factor 1 (HSF1), the transcriptional regulator of Clu . Our findings unravel a new dimension of stromal heterogeneity, influenced by germline mutations in cancer cells, with direct translational implications for clinical research. Significance BRCA1 / 2 mutations initiate some of the deadliest cancers, yet the fibroblastic microenvironment of BRCA -mutated cancers remains uncharted. Our work addresses a major unsolved question – to what extent is the tumor microenvironment determined by cancer mutations? We find that BRCA mutations in the cancer cells affect the composition of CAFs in PDAC. These findings have direct implications for diagnosis and for efforts to exploit CAFs for therapy.

Abstract Aim To estimate scenarios for survival for patients with estrogen receptor (ER) positive, metastatic breast cancer (MBC) and to help communicate prognosis to patients starting endocrine therapy (ET) Methods We searched for randomized trials of ET for ER‐positive MBC and extracted the following percentiles (representative survival scenarios) from each overall survival (OS) curve: 90th (worst‐case), 75th (lower‐typical), 50th (median), 25th (upper‐typical), and 10th (best‐case). We then assessed the accuracy of estimating these percentiles for each OS curve by multiplying the median OS by four simple multiples: 0.25 (to estimate the 90th percentile), 0.5 (75th), 2 (25th), and 3 (10th). Estimates were deemed accurate if it fell within 0.75–1.33 times the actual value. Results We identified 25 trials with 10,566 patients. The median OS (interquartile range) was: 61.3 months (53.4–64.8) for first‐line ET with cyclin‐dependant kinase 4/6 inhibitors (four treatment groups); 42.6 months (40.9–50.4) for first‐line ET alone (21 treatment groups) and 29.2 months (24.8–33.4) for subsequent line ET (19 treatment groups). Simple multiples of the median OS accurately estimated the 90th percentile in 80%; 75th percentile in 93%; and 25th percentile in 76% of curves. The 10th percentile was only available for four OS curves and could not be evaluated. Conclusion Simple multiples of the median OS are a helpful and accurate method to assist in estimating and discussing scenarios for survival for MBC patients starting ET. Longer follow‐up of trials is required to help clinicians estimate the best‐case scenario.

BACKGROUND: R -Glabridin is a major flavonoid of licorice ( Glycyrrhiza glabra ) root and known to modulate GABA A receptors, which are targets of many clinical hypnotics. However, R -glabridin hypnotic activity has not been reported in animals. METHODS: Inverted photomotor responses (IPMRs) were used to assess the hypnotic effects of natural R -glabridin and synthetic R/S -glabridin in wild-type zebrafish larvae and transgenic larvae lacking functional GABA A receptor β3 subunits (β3 0/0 ). Two-electrode voltage-clamp electrophysiology in Xenopus oocytes heterologously expressing ion channels quantified the effects of R -glabridin on wild-type and mutated human α1β3γ2L GABA A receptors, NR1B/NR2A N-methyl-D-aspatate (NMDA) receptors, and α4β2 neuronal nicotinic (nnACh) receptors. RESULTS: IPMRs in wild-type zebrafish larvae identified R/S -glabridin as an inhibitor (IC50 = 7.5 µM; 95% confidence interval [CI], 5.9–9.3 µM) that was about half as potent as R -glabridin (IC50 = 4.4. µM; 95% CI, 3.6–5.4 µM). In β3 0/0 zebrafish larvae, R -glabridin inhibited IPMRs with IC50 = 7.5 µM (95% CI, 5.6–10.0 µM). Electrophysiologic studies revealed that R -glabridin directly activated and positively modulated α1β3γ2L GABA A receptors. Modulation was significantly reduced by α1L232W and β3N265M mutations in the β+/α- transmembrane intersubunit sites where etomidate binds, but not by 5 other point mutations in 4 other transmembrane modulator binding sites. NMDA and nnACh receptors were inhibited by R -glabridin. DISCUSSION/CONCLUSIONS: Our findings in zebrafish larvae indicate that IPMR inhibition by R -glabridin is more potent than S -glabridin and that β3-containing GABA A receptors contribute significantly to this behavioral effect. Molecular studies show that R -glabridin modulates at least 3 known anesthetic-sensitive ion channels, suggesting that it is a multimodal hypnotic.

Abstract Tumor cell amplification of the MYCN transcription factor is seen in half of patients with high-risk neuroblastoma, where it functions as an oncogenic driver associated with metastatic disease and poor survival. Yet, direct targeting of MYCN has been met with little success, prompting efforts to inhibit its expression at multiple levels. MYCN-amplified neuroblastoma cells have an increased requirement for protein synthesis to meet the overwhelming transcriptional burden imposed by oncogenic MYCN. Here, we take advantage of this vulnerability to interrogate the therapeutic potential of inhibiting the activity of the eukaryotic translation initiation factor 4A1 (eIF4A1), an RNA-helicase responsible for resolving structural barriers such as polypurine preponderance within 5′ untranslated regions (UTRs). We observed that eIF4A1 is a key regulator of transcript-specific mRNA recruitment in MYCN-overexpressing neuroblastomas and MYCN-associated transcripts rank highly in polypurine-rich 5′ UTR sequences, the majority of which have critical roles in cell proliferation. Using CMLD012824, a novel synthetic amidino-rocaglate (ADR) derivative, we demonstrate selectively increased eIF4A1 affinity for polypurine-rich 5′ UTRs, including the MYCN mRNA, leading to translation inhibition and cytotoxicity in human neuroblastoma cell lines and animal models. Through ribosome profiling and PAR-CLIP analysis, we show that ADR-mediated clamping of eIF4A1 onto mRNA spans the full lengths of target transcripts, whereas translational inhibition is mediated selectively through 5′ UTR binding. Both cap-dependent and cap-independent translation of MYCN are disrupted, pointing to the ability of CMLD012824 to disrupt non-canonical translation initiation. Our studies provide insights into the functional role of eIF4A1 in meeting the increased protein synthesis demands of MYCN-amplified neuroblastoma and suggest that its disruption may be therapeutically beneficial in this disease.