Host cells impose a broad range of obstacles to the replication of retroviruses. Tetherin (also known as CD317, BST-2 or HM1.24) impedes viral release by retaining newly budded HIV-1 virions on the surface of cells. HIV-1 Vpu efficiently counteracts this restriction. Here, we show that HIV-1 Vpu induces the depletion of tetherin from cells. We demonstrate that this phenomenon correlates with the ability of Vpu to counteract the antiviral activity of both overexpressed and interferon-induced endogenous tetherin. In addition, we show that Vpu co-immunoprecipitates with tetherin and β-TrCP in a tri-molecular complex. This interaction leads to Vpu-mediated proteasomal degradation of tetherin in a β-TrCP2-dependent manner. Accordingly, in conditions where Vpu-β-TrCP2-tetherin interplay was not operative, including cells stably knocked down for β-TrCP2 expression or cells expressing a dominant negative form of β-TrCP, the ability of Vpu to antagonize the antiviral activity of tetherin was severely impaired. Nevertheless, tetherin degradation did not account for the totality of Vpu-mediated counteraction against the antiviral factor, as binding of Vpu to tetherin was sufficient for a partial relief of the restriction. Finally, we show that the mechanism used by Vpu to induce tetherin depletion implicates the cellular ER-associated degradation (ERAD) pathway, which mediates the dislocation of ER membrane proteins into the cytosol for subsequent proteasomal degradation. In conclusion, we show that Vpu interacts with tetherin to direct its β-TrCP2-dependent proteasomal degradation, thereby alleviating the blockade to the release of infectious virions. Identification of tetherin binding to Vpu provides a potential novel target for the development of drugs aimed at inhibiting HIV-1 replication.

Abstract Transgenic tomato (Solanum lycopersicum) plants expressing a fragment of the Sl SDH2-2 gene encoding the iron sulfur subunit of the succinate dehydrogenase protein complex in the antisense orientation under the control of the 35S promoter exhibit an enhanced rate of photosynthesis. The rate of the tricarboxylic acid (TCA) cycle was reduced in these transformants, and there were changes in the levels of metabolites associated with the TCA cycle. Furthermore, in comparison to wild-type plants, carbon dioxide assimilation was enhanced by up to 25% in the transgenic plants under ambient conditions, and mature plants were characterized by an increased biomass. Analysis of additional photosynthetic parameters revealed that the rate of transpiration and stomatal conductance were markedly elevated in the transgenic plants. The transformants displayed a strongly enhanced assimilation rate under both ambient and suboptimal environmental conditions, as well as an elevated maximal stomatal aperture. By contrast, when the Sl SDH2-2 gene was repressed by antisense RNA in a guard cell–specific manner, changes in neither stomatal aperture nor photosynthesis were observed. The data obtained are discussed in the context of the role of TCA cycle intermediates both generally with respect to photosynthetic metabolism and specifically with respect to their role in the regulation of stomatal aperture.

Up to one-third of all described marine species occur in coral reefs, but the future of these hyperdiverse ecosystems is insecure due to local and global threats, such as overfishing, eutrophication, ocean warming and acidification. Although these impacts are expected to have a net detrimental effect on reefs, it has been shown that some organisms like octocorals may remain unaffected, or benefit from, anthropogenically induced environmental change, replacing stony corals in future reefs. Despite their importance in future shallow-water environments, the molecular mechanisms leading to the resilience to anthropogenic-induced stress observed in octocorals remain unknown. Here, we use manipulative experiments, proteomics, and transcriptomics to show that the molecular toolkit used by Pinnigorgia flava, a common Indo-Pacific gorgonian octocoral, to deposit its calcium-carbonate skeleton is resilient under simulated climate change. Sublethal, simulated global warming triggered a stress response in P. flava but did not affect the expression of 27 transcripts that encode Skeletal Organic Matrix (SOM) proteins present in this species9 skeleton. Exposure to simulated ocean acidification did not cause a stress response but triggered the downregulation of many transcripts, including an osteonidogen homolog present in the SOM. The observed transcriptional decoupling of the skeletogenic and stress-response toolkits provides a mechanistic explanation for the resilience to anthropogenically-driven environmental change observed in octocorals.

Abstract Epsl5-homology domain containing protein 2 (EHD2) is a dynamin-related ATPase located at the neck of caveolae, but its physiological function has remained unclear. Here, we found that global genetic ablation of EHD2 in mice led to increased fat accumulation. This organismic phenotype was paralleled at the cellular level by increased lipid uptake via a caveolae-, dynamin- and CD36-dependent pathway, an elevated number of detached caveolae and higher caveolar mobility. Furthermore, EHD2 expression itself was down-regulated in the visceral fat of two obese mouse models and obese patients. Our data suggest that EHD2 controls a cell-autonomous, caveolae-dependent lipid uptake pathway and suggest that low EHD2 expression levels are linked to obesity.

ABSTRACT Rhodamine molecules are setting benchmarks in fluorescence microscopy. Herein, we report the deuterium (d12) congeners of tetramethyl(silicon)rhodamine, obtained by isotopic labelling of the four methyl groups, which improves photophysical ( i.e. brightness, lifetimes) and chemical ( i.e. bleaching) properties. We explore this finding for SNAP- and Halo-tag labelling, and highlight enhanced properties in several applications, such as Förster resonance energy transfer, fluorescence activated cell sorting, fluorescence lifetime microscopy and stimulated emission depletion nanoscopy. We envision deuteration as a generalizable concept to improve existing and develop new Chemical Biology Probes.

Abstract The specific functions of cellular organelles and sub-compartments depend on their protein content, which can be characterized by spatial proteomics approaches. However, many spatial proteomics methods are limited in their ability to resolve organellar sub-compartments, profile multiple sub-compartments in parallel, and/or characterize membrane-associated proteomes. Here, we develop a cross-link assisted spatial proteomics (CLASP) strategy that addresses these shortcomings. Using human mitochondria as a model system, we show that CLASP can elucidate spatial proteomes of all mitochondrial sub-compartments and provide topological insight into the mitochondrial membrane proteome in a single experiment. Biochemical and imaging-based follow-up studies demonstrate that CLASP allows discovering mitochondria-associated proteins and revising previous protein sub-compartment localization and membrane topology data. This study extends the scope of cross-linking mass spectrometry beyond protein structure and interaction analysis towards spatial proteomics, establishes a method for concomitant profiling of sub-organelle and membrane proteomes, and provides a resource for mitochondrial spatial biology.

Abstract Caveolae are small coated inner plasma membrane invaginations found in many cell types. Their diverse functions span from endocytosis to signaling, regulating key cellular processes including lipid uptake, pathogen entry, and membrane tension. Caveolae undergo shape changes from flat to curved. It is unclear which proteins regulate this process. To address this gap, we studied the shapes of caveolae with platinum replica electron microscopy in six common cell types. Next, we developed a correlative multi-color stimulated emission depletion (STED) fluorescence and platinum replica EM imaging (CLEM) method to image caveolae-associated proteins at caveolae of different shapes at the nanoscale. Caveolins and cavins were found at all caveolae, independent of their curvature. EHD2, a classic caveolar neck protein, was strongly detected at both curved and flat caveolae. Both pacsin2 and the regulator EHBP1 were found only at a subset of caveolae. Pacsin2 was localized primarily to areas surrounding flat caveolae, whereas EHBP1 was mostly detected at spheres. Contrary to classic models, dynamin was absent from caveolae and localized only to clathrin-coated structures. Cells lacking dynamin showed no substantial changes to caveolae, suggesting that dynamin is not directly involved in caveolae curvature. Together, we provide a mechanistic map for the molecular control of caveolae shape by eight of the major caveolae-associated coat and regulatory proteins. We propose a model where caveolins, cavins, and EHD2 assemble as a cohesive structural unit regulated by more intermittent associations with pacsin2 and EHBP1. These complexes can flatten and curve, capturing membrane to enable lipid traffic and changes to the surface area of the cell.

ABSTRACT Sulfonated rhodamines that endow xanthene dyes with cellular impermeability are presented. We fuse charged sulfonates to red and far-red dyes to obtain Sulfo549 and Sulfo646, respectively, and further link these to SNAP- and Halo-tag substrates for protein self-labelling. Cellular impermeability is validated in live cell imaging experiments in transfected HEK cells and neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs). Lastly, we show that Sulfo646 is amenable to STED nanoscopy by recording membranes of SNAP/Halo-surface-labelled human iPSC-derived neuronal axons. We therefore provide an avenue for rendering dyes impermeable for exclusive extracellular visualization via self-labelling protein tags.

Summary Reliable delivery of presynaptic material, including active zone and synaptic vesicle proteins from neuronal somata to synaptic terminals is prerequisite for faithful synaptogenesis and neurotransmission. However, molecular mechanisms controlling the somatic assembly of presynaptic precursors remain insufficiently understood. Here we show that in mutants of the small GTPase RAB2 active zone and synaptic vesicle proteins accumulated in the neuronal somata at the trans -Golgi network and were consequently depleted at synaptic terminals, provoking neurotransmission deficits. The ectopic presynaptic material accumulations consisted of heterogeneous vesicles and short tubules of 40×60 nm and segregated in subfractions either positive for active zone proteins or co-positive for synaptic vesicle proteins and LAMP1, a lysosomal membrane protein. Genetically, rab2 behaved epistatic over arl8 , a lysosomal adaptor controlling axonal export of precursors. Collectively, we here identified a Golgi-associated assembly sequence in presynaptic precursor vesicle biogenesis controlled by RAB2 dependent membrane remodelling and protein sorting at the trans -Golgi.