Abstract Background The combination of long-reads and long-range information to produce genome assemblies is now accepted as a common standard. This strategy not only allow to access the gene catalogue of a given species but also reveals the architecture and organisation of chromosomes, including complex regions like telomeres and centromeres. The Brassica genus is not exempt and many assemblies based on long reads are now available. The reference genome for Brassica napus , Darmor-bzh, which was published in 2014, has been produced using short-reads and its contiguity was extremely low if compared to current assemblies of the Brassica genus. Findings Here, we report the new long-reads assembly of Darmor-bzh genome ( Brassica napus ) generated by combining long-reads sequencing data, optical and genetic maps. Using the PromethION device and six flowcells, we generated about 16M long-reads representing 93X coverage and more importantly 6X with reads longer than 100Kb. This ultralong-reads dataset allows us to generate one of the most contiguous and complete assembly of a Brassica genome to date (contigs N50 > 10Mb). In addition, we exploited all the advantages of the nanopore technology to detect modified bases and sequence transcriptomic data using direct RNA to annotate the genome and focus on resistance genes. Conclusion Using these cutting edge technologies, and in particular by relying on all the advantages of the nanopore technology, we provide the most contiguous Brassica napus assembly, a resource that will be valuable for the Brassica community for crop improvement and will facilitate the rapid selection of agronomically important traits.

ABSTRACT Traditionally, reference genomes in crop species rely on the assembly of one accession, thus occulting most of intraspecific diversity. However, rearrangements, gene duplications and transposable element content may have a large impact on the genomic structure, which could generate new phenotypic traits. Using two Brassica rapa genomes recently sequenced and assembled using long-read technology and optical mapping, we investigated structural variants and repetitive content between the two accessions and genome size variation among a core collection. We explored the structural consequences of the presence of large repeated sequences in B. rapa ‘Z1’ genome versus the B. rapa ‘Chiifu’ genome, using comparative genomics and cytogenetic approaches. First, we showed that large genomic variants on chromosomes A05, A06, A09 and A10 are due to large insertions and inversions when comparing B. rapa ‘Z1’ and B. rapa ‘Chiifu’ at the origin of important length differences in some chromosomes. For instance, lengths of ‘Z1’ and ‘Chiifu’ A06 chromosomes were estimated in silico to be 55Mb and 29Mb, respectively. To validate these observations, we compared using fluorescent in-situ hybridization (FISH) the two A06 chromosomes present in a F1 hybrid produced by crossing these two varieties. We confirmed a length difference of 17.6% between the A06 chromosomes of ‘Z1’ compared to ‘Chiifu’. Alternatively, using a Copy Number Variation approach, we were able to quantify the presence of a higher number of rDNA and Gypsy elements in ‘Z1’ genome compared to ‘Chiifu’ on different chromosomes including A06. Using flow cytometry, the total genome size of 12 Brassica accessions corresponding to a B. rapa available core collection was estimated and revealed a genome size variation of up to 16% between these accessions as well as some shared inversions. This study revealed the contribution of long-read sequencing of new accessions belonging to different cultigroups of B. rapa and highlighted the potential impact of differential insertion of repeat elements and inversions of large genomic regions in genome size intraspecific variability.

Allopolyploidy, combining interspecific hybridization with whole genome duplication, has had significant impact on plant evolution. Its evolutionary success is related to the rapid and profound genome reorganizations that allow neo-allopolyploids to form and adapt. Nevertheless, how neo-allopolyploid genomes adapt to regulate their expression remains poorly understood. The hypothesis of a major role for small non-coding RNAs (sRNAs) in mediating the transcriptional response of neo-allopolyploid genomes has progressively emerged. Generally, 21-nt sRNAs mediate post-transcriptional gene silencing (PTGS) by mRNA cleavage whereas 24-nt sRNAs repress transcription (transcriptional gene silencing, TGS) through epigenetic modifications. Here, we characterize the global response of sRNAs to allopolyploidy in Brassica, using three independently resynthesized B. napus allotetraploids surveyed at two different generations in comparison with their diploid progenitors. Our results suggest an immediate but transient response of specific sRNA populations to allopolyploidy. These sRNA populations mainly target non-coding components of the genome but also target the transcriptional regulation of genes involved in response to stresses and in metabolism; this suggests a broad role in adapting to allopolyploidy. We finally identify the early accumulation of both 21- and 24-nt sRNAs involved in regulating the same targets, supporting a PTGS-to-TGS shift at the first stages of the neo-allopolyploid formation. We propose that reorganization of sRNA production is an early response to allopolyploidy in order to control the transcriptional reactivation of various non-coding elements and stress-related genes, thus ensuring genome stability during the first steps of neo-allopolyploid formation.

Abstract Plants as animals are strictly associated with a cortege of microbial communities influencing their health, fitness and evolution. Therefore, scientists refer to all living organisms as holobionts; complex genetic units that coevolve simultaneously. This is what has been recently proposed as the hologenome theory of evolution. This exciting and attractive theory has important implications on animal and plant health; however, it still needs consistent proof to be validated. Indeed, holobionts are still poorly studied in their natural habitats where coevolution and natural selective processes occur. Compared to animals and crops, wild plant populations are an excellent and unique model to explore the hologenome theory. These sessile holobionts have strictly coevolved with their microbiota for decades and natural selection and adaptive processes acting on wild plants are likely to regulate the plant-microbe interactions. Here we conducted for the first time a microbiota survey, plant genome sequencing and Genome-Environmental Analysis (GEA) of 26 natural populations of the non-model plant species Brassica rapa . We collected plants over two seasons in Italy and France, and analyzed the microbiota on two plant compartments (root and rhizosphere). We identified that plant compartment and season modulate B. rapa microbiota. More importantly, when conducting GEA we evidenced neat peaks of association correlating with both fungal and bacterial microbiota. Surprisingly, we found 13 common genes between fungal and bacterial diversity descriptors that we referred under the name of Holobiont Generalist Genes (HGG). These genes might strongly regulate the diversity and composition of plant microbiota at the inter-kingdom level. Significance Statement The novel hologenome concept claims that hosts and their associated microbes (considered as holobionts) are a unique evolutionary unit on which natural selection acts. Thus, the hologenome theory assumes that hosts and microbiomes simultaneously coevolve. This novel vision of universal evolutionary entities is promising for both animal and plant health purposes. However, it is still quietly controversial as it suffers from a lack of tangible evidence. How can we enrich the debate on holobionts? How can we translate this concept in discoveries that can change farming practices? Our study is filling the gaps of the hologenome theory by showing that certain genes under natural selection and regulating plant microbiota are generalist in response to fungal and bacterial communities.

Abstract Meiotic recombination is a key biological process in plant evolution and breeding, as it generates novel genetic diversity at each generation. However, due to its importance in chromosome segregation and genomic stability, crossovers are highly regulated in both frequency and distribution. We previously demonstrated that this strict regulation is not a fatality and that it can be naturally modified (3.6-fold increased frequency and altered distribution) in an allotriploid Brassica hybrid (2 n =3 x =29; AAC), resulting from a cross between B. napus (2 n =4 x =38; AACC) and B. rapa (2 n =2 x =20; AA). Taking advantage of the recently updated Brassica napus genome assembly, which now includes the pericentromeric regions, we unambiguously demonstrated that crossovers occur in these normally cold regions in allotriploids, with the presence of crossovers as close as 375 kb from the centromere. We deciphered that this modified recombination landscape (both frequency and distribution) can be maintained in successive generations of allotriploidy, with even a slight increase of crossover frequency. We also showed that this deregulated meiotic behavior may revert back to a strictly regulated one when recovering an allotetraploid progeny in the second generation. Overall, we provide here for the first time a practical and natural way to switch on and off the tight recombination control in a polyploid crop. We also discuss the potential role of this modified regulation of recombination in polyploid speciation success.

Abstract Agriculture faces great challenges to overcome global warming and to improve system sustainability, requiring access to novel genetic diversity. So far, wild populations and local landraces remain poorly explored. This is notably the case for the two diploid species, Brassica oleracea L. (CC, 2n=2x=18) and B. rapa L. (AA, 2n=2x=20). In order to explore genetic diversity in both species, we have collected numerous populations in their center of origin, the Mediterranean basin, on a large contrasting climatic and soil gradient from northern Europe to southern sub-Saharan regions. In these areas, we also collected 14 populations belonging to five B. oleracea closely related species. Before further genetic and agronomic investigations, we controlled the absence of species misidentification using flow cytometry, sequencing of species specific chloroplast genomic region, as well as cytogenetic analyses in case of unexpected results. Looking at the 102 B. oleracea and 146 B. rapa populations showing a good germination among the 112 and 154 populations collected, seventeen populations were misidentified. The most frequent mistake was a confusion of these diploid species with B. napus . Additionally for B. rapa , 2 autotetraploid populations were observed. Habitats of the collected wild populations and landraces are described in our work. This provides a unique plant material characterization that will pave the way for further analyses investigating the genomic regions involved in climatic and microbiota adaptation. This research is supported by the H2020 Prima project ‘BrasExplor’.

SUMMARY Allopolyploids have globally higher fitness than their diploid progenitors however, by comparison, most resynthesized allopolyploids have poor fertility and highly unstable genome. Elucidating the evolutionary processes promoting genome stabilization and fertility is thus essential to comprehend allopolyploid success. Using the Brassica model, we mimicked the speciation process of a nascent allopolyploid species by resynthesizing allotetraploid B. napus and systematically selecting for euploid individuals over eight generations in four independent allopolyploidization events with contrasted genetic backgrounds, cytoplasmic donors and polyploid formation type. We evaluated the evolution of meiotic behavior, fertility and identified rearrangements in S1 to S9 lineages, to explore the positive consequences of euploid selection on B. napus genome stability. Recurrent selection of euploid plants for eight generations drastically reduced the percentage of aneuploid progenies as early as the fourth generation, concomitantly with a quasi disappearance of newly fixed homoeologous rearrangements. The consequences of homoeologous rearrangements on meiotic behavior and seed number strongly depended on the genetic background and cytoplasm donor. The combined use of both self-fertilisation and outcrossing as well as recurrent euploid selection, allowed identification of genomic regions associated with fertility and meiotic behavior, providing complementary evidence to explain B. napus speciation success.