Mounting evidence suggests that neuronal activity influences myelination, potentially allowing for experience-driven modulation of neural circuitry. The degree to which neuronal activity is capable of regulating myelination at the individual axon level is unclear. Here we demonstrate that stimulation of somatosensory axons in the mouse brain increases proliferation and differentiation of oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) within the underlying white matter. Stimulated axons display an increased probability of being myelinated compared to neighboring non-stimulated axons, in addition to being ensheathed with thicker myelin. Conversely, attenuating neuronal firing reduces axonal myelination in a selective activity-dependent manner. Our findings reveal that the process of selecting axons for myelination is strongly influenced by the relative activity of individual axons within a population. These observed cellular changes are consistent with the emerging concept that adaptive myelination is a key mechanism for the fine-tuning of neuronal circuitry in the mammalian CNS.

Parenchymal oligodendrocyte progenitor cells (pOPCs) are considered the principal cell type responsible for oligodendrogenesis and remyelinaton in demyelinating diseases. Recent studies have demonstrated that neural precursor cells (NPCs) from the adult subventricular zone (SVZ) can also generate new oligodendrocytes after demyelination. However, the relative contribution of NPCs versus pOPCs to remyelination is unknown. We used in vivo genetic fate mapping to assess the behavior of each progenitor type within the corpus callosi (CCs) of mice subjected to cuprizone-induced demyelination. Nestin-CreER T2 and Pdgfra-CreER T2 transgenic mice were crossed with fluorescent Cre reporter strains to map the fate of NPCs and pOPCs respectively. In cuprizone-challenged mice, substantial numbers of NPCs migrated into the demyelinated CC and contributed to oligodendrogenesis. This capacity was most prominent in rostral regions adjacent to the SVZ where NPC-derived oligodendrocytes significantly outnumbered those generated from pOPCs. Sixty-two percent of all nodes of Ranvier in this region were flanked by at least one paranode generated from an NPC-derived oligodendrocyte. Remarkably, g-ratios (ratio of the axon diameter to the diameter of the axon plus myelin sheath) of myelinated axons in regions subject to significant NPC-derived remyelination were equivalent to those of unchallenged controls, and immunoelectron microscopy revealed that NPC-derived myelin was significantly thicker than that generated by pOPCs, regardless of axonal caliber. We also demonstrate that a reduced efficiency of remyelination in the caudal CC was associated with long-term impairment in the maturation of oligodendrogenic NPCs but only transient delay in pOPC differentiation. Collectively, our data define a major distinct role for NPCs in remyelination, identifying them as a key target for enhancing myelin repair in demyelinating diseases.

Reactive astrocytes play critical roles after brain injuries but their precise function in stroke is not well defined. Here, we utilized single nuclei transcriptomics to characterize astrocytes after ischemic stroke in nonhuman primate (NHP) marmoset monkey primary visual cortex. We identified 19 putative subtypes of astrocytes from injured and uninjured brain hemispheres and observed nearly complete segregation between stroke and control astrocyte clusters. We then screened for genes that might be limiting stroke recovery and discovered that one neurite-outgrowth inhibitory protein, NogoA, previously associated with oligodendrocytes but not astrocytes, was expressed in numerous reactive astrocyte subtypes. NogoA upregulation on reactive astrocytes was confirmed in vivo for NHP and human, but not observed to the same extent in rodent. Further in vivo and in vitro studies determined that NogoA mediated an anti-inflammatory response which limits deeper infiltration of peripheral macrophages from the lesion during the subacute post-stroke period. Specifically, these findings are relevant to the development of NogoA-targeting therapies shortly after ischemic stroke. Our findings have uncovered the complexity and species specificity of astrocyte responses, which need to be considered more when investigating novel therapeutics for brain injury.

Abstract Approaches to investigate adult oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) by targeted cell ablation in the rodent central nervous system have been limited by methodological challenges resulting in only partial and transient OPC depletion. We have developed a novel pharmacogenetic model of conditional OPC ablation, eliminating 98.6% of all OPCs throughout the brain. By combining recombinase-based transgenic and viral strategies for targeting OPCs and ventricular-subventricular zone (V-SVZ)-derived neural precursor cells (NPCs), we found new PDGFRA-expressing cells born in the V-SVZ repopulated the OPC-deficient brain starting 12 days after OPC ablation. Our data reveal that OPC depletion induces V-SVZ-derived NPCs to generate vast numbers of PDGFRA + NG2 + cells with the capacity to migrate and proliferate extensively throughout the dorsal anterior forebrain. Further application of this novel approach to ablate OPCs will advance knowledge of the function of both OPCs and oligodendrogenic NPCs in health and disease.

A mechanistic connection between aging and development is largely unexplored. Through profiling age-related chromatin and transcriptional changes across 22 murine cell types, analyzed alongside previous mouse and human organismal maturation datasets, we uncovered a transcription factor binding site (TFBS) signature common to both processes. Early-life candidate cis-regulatory elements (cCREs), progressively losing accessibility during maturation and aging, are enriched for cell-type identity TFBSs. Conversely, cCREs gaining accessibility throughout life have a lower abundance of cell identity TFBSs but elevated activator protein 1 (AP-1) levels. We implicate TF redistribution toward these AP-1 TFBS-rich cCREs, in synergy with mild downregulation of cell identity TFs, as driving early-life cCRE accessibility loss and altering developmental and metabolic gene expression. Such remodeling can be triggered by elevating AP-1 or depleting repressive H3K27me3. We propose that AP-1-linked chromatin opening drives organismal maturation by disrupting cell identity TFBS-rich cCREs, thereby reprogramming transcriptome and cell function, a mechanism hijacked in aging through ongoing chromatin opening.

Abstract Molecular cloning techniques enabling contemporaneous expression of two or more protein-coding sequences in a cell type of interest provide an invaluable tool for understanding the molecular regulation of cellular functions. DNA recombination employing the Cre-lox system is commonly used as a molecular switch for inducing the expression of recombinant proteins encoded within a bicistronic cassette. In such an approach, the two protein-coding sequences are separated by a 2A peptide or internal ribosome entry site (IRES), and expression is designed to be strictly Cre-dependent by using a lox -STOP- lox cassette or flip-excision (FLEX) switch. However, low-level or ‘leaky’ expression of recombinant proteins is often observed in the absence of Cre activity, potentially compromising the utility of this approach. To investigate the mechanism of leaky gene expression, we generated pCAG-lox-GFP-STOP-lox-Transgene A-2A-Transgene B vectors, which are designed to express nuclear-targeted GFP in the absence of Cre, and express both transgenes A and B after Cre-mediated recombination. We found that cells transfected with these bicistronic vectors exhibited low-level Cre-independent expression specifically of the transgene positioned 3′ of the 2A peptide. We observed similar results in vivo by viral transduction of the adult mouse cerebral cortex with AAV-mutagenesis of putative transcription factor binding sites that the 5′ transgene confers promoter-like activity that drives expression of the 3′ transgene. Finally, we demonstrate that inclusion of an additional lox-STOP-lox cassette between the 2A sequence and 3′ transgene dramatically reduces the extent of Cre-independent leaky gene expression. Our findings highlight that caution should be applied to the use of Cre-dependent bicistronic constructs when tight regulation of transgene expression is desired and provide a guide to preventing leaky gene expression when the expression of more than one protein is required.

Abstract In multiple sclerosis (MS), chronic demyelination initiated by immune-mediated destruction of myelin, leads to axonal damage and neuronal cell death, resulting in a progressive decline in neurological function. The development of interventions that potentiate remyelination could hold promise as a novel treatment strategy for MS. To this end, our group has demonstrated that neural precursor cells (NPCs) residing in the ventricular-subventricular zone (V-SVZ) of the adult mouse brain contribute significantly to remyelination in response to central nervous system (CNS) demyelination and can regenerate myelin of normal thickness. However, aging takes its toll on the regenerative potential of NPCs and reduces their contribution to remyelination. In this study, we investigated how aging influences the contribution of NPCs to oligodendrogenesis during the remyelination process and whether the delivery of growth factors into the brains of aged mice could potentiate the oligodendrogenic potential of NPCs. To enable us to map the fate of NPCs in response to demyelination induced at different postnatal ages, Nestin-CreER T2 ; Rosa26-LSL-eYFP mice were gavaged with tamoxifen at either 8 weeks, 30 weeks or one year of age before being challenged with cuprizone for a period of six weeks. Using osmotic minipumps, we infused heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF), and/or epidermal growth factor (EGF) into the cisterna magna for a period of two weeks beginning at the peak of cuprizone-induced demyelination (n=6-8 mice per group). Control mice received artificial cerebrospinal fluid (vehicle) alone. Mice were perfused six weeks after cuprizone withdrawal and the contribution of NPCs to oligodendrocyte regeneration in the corpus callosum was assessed. Our data reveal that although NPC-derived oligodendrocyte generation declined dramatically with age, this decline was partially reversed by growth factor infusion. Notably, co-infusion of EGF and HB-EGF increased oligodendrocyte regeneration twofold in some regions of the corpus callosum. Our results shed light on the beneficial effects of EGF and HB-EGF for increasing the contribution of NPCs to remyelination and indicate their therapeutic potential to combat the negative effects of aging upon remyelination efficacy.

Molecular cloning techniques enabling contemporaneous expression of two or more protein-coding sequences provide an invaluable tool for understanding the molecular regulation of cellular functions. The Cre-lox system is used for inducing the expression of recombinant proteins encoded within a bi-/poly-cistronic cassette. However, leak expression of transgenes is often observed in the absence of Cre recombinase activity, compromising the utility of this approach. To investigate the mechanism of leak expression, we generated Cre-inducible bi-cistronic vectors to monitor the expression of transgenes positioned either 5' or 3' of a 2A peptide or internal ribosomal entry site (IRES) sequence. Cells transfected with these bi-cistronic vectors exhibited Cre-independent leak expression specifically of transgenes positioned 3' of the 2A peptide or IRES sequence. Similarly, AAV-