Targeted degradation of cell surface and extracellular proteins via lysosomal delivery is an important means to modulate extracellular biology. However, these approaches have limitations due to lack of modularity, ease of development, restricted tissue targeting and applicability to both cell surface and extracellular proteins. We describe a lysosomal degradation strategy, termed cytokine receptor-targeting chimeras (KineTACs), that addresses these limitations. KineTACs are fully genetically encoded bispecific antibodies consisting of a cytokine arm, which binds its cognate cytokine receptor, and a target-binding arm for the protein of interest. We show that KineTACs containing the cytokine CXCL12 can use the decoy recycling receptor, CXCR7, to target a variety of target proteins to the lysosome for degradation. Additional KineTACs were designed to harness other CXCR7-targeting cytokines, CXCL11 and vMIPII, and the interleukin-2 (IL-2) receptor-targeting cytokine IL-2. Thus, KineTACs represent a general, modular, selective and simple genetically encoded strategy for inducing lysosomal delivery of extracellular and cell surface targets with broad or tissue-specific distribution.

Immunotargeting of tumor-specific antigens is a powerful therapeutic strategy. Immunotherapies directed at MHC-I complexes have expanded the scope of antigens and enabled the direct targeting of intracellular oncoproteins at the cell surface. We asked whether covalent drugs that alkylate mutated residues on oncoproteins could act as haptens to generate unique MHC-I-restricted neoantigens. Here, we report that KRAS G12C mutant cells treated with the covalent inhibitor ARS1620 present ARS1620-modified peptides in MHC-I complexes. Using ARS1620-specific antibodies identified by phage display, we show that these haptenated MHC-I complexes can serve as tumor-specific neoantigens and that a bispecific T cell engager construct based on a hapten-specific antibody elicits a cytotoxic T cell response against KRAS G12C cells, including those resistant to direct KRAS G12C inhibition. With multiple K-RAS G12C inhibitors in clinical use or undergoing clinical trials, our results present a strategy to enhance their efficacy and overcome the rapidly arising tumor resistance.

Abstract A central challenge for any therapeutic is targeting diseased over normal cells. Proteolysis is frequently upregulated in disease and can generate proteoforms with unique neo-epitopes. We hypothesize that targeting proteolytic neo-epitopes can enable more effective and safer treatments, reflecting a conditional layer of disease-specific regulation. Here, we characterized the precise proteolytic isoforms of CUB domain containing protein 1 (CDCP1), a protein overexpressed and specifically cleaved in RAS-driven cancers. We validated that the N-terminal and C-terminal fragments of CDCP1 remain associated after proteolysis in vitro and on the surface of pancreatic cancer cells. Using a differential phage display strategy, we generated exquisitely selective recombinant antibodies that target cells harboring cleaved CDCP1 and not the full-length form using antibody-drug conjugates or a bi-specific T-cell engagers. We show tumor-specific localization and anti-tumor activity in a syngeneic pancreatic tumor model having superior safety profiles compared to a pan-CDCP1-targeting antibody. Our studies show proteolytic neo-epitopes can provide an orthogonal “AND” gate for disease-specific targeting. One-Sentence Summary Antibody-based targeting of neo-epitopes generated by disease-associated proteolysis improves the therapeutic index

Abstract CD38 is a surface ectoenzyme expressed at high levels on myeloma plasma cells and is the target for the monoclonal antibodies (mAbs) daratumumab and isatuximab. CD38 density on tumor cells is an important determinant of mAb efficacy, and CD38 loss after mAb treatment may play a role in resistance. Several small molecules have been found to increase tumor surface CD38, with the goal of boosting mAb efficacy in a co-treatment strategy. Here we sought to extend our currently limited insight into CD38 surface expression by using a multi-omics approach. Genome-wide CRISPR-interference screens integrated with patient-centered epigenetic analysis confirmed known regulators of CD38 , such as RARA, while revealing XBP1 and SPI1 as other key transcription factors governing surface CD38 levels. CD38 knockdown followed by cell surface proteomics demonstrated no significant remodeling of the myeloma “surfaceome” after genetically-induced loss of this antigen. Integrated transcriptome and surface proteome data confirmed high specificity of all-trans retinoic acid in upregulating CD38 in contrast to broader effects of azacytidine and panobinostat. Finally, unbiased phosphoproteomics identified inhibition of MAP kinase pathway signaling in tumor cells after daratumumab treatment. Our work provides a resource to design strategies to enhance efficacy of CD38-targeting immunotherapies in myeloma.

ABSTRACT Safely expanding indications for cellular therapies has been challenging given a lack of highly cancer-specific surface markers. Here, we explore the hypothesis that tumor cells express cancer-specific surface protein conformations, invisible to standard target discovery pipelines evaluating gene or protein expression, that can be identified and immunotherapeutically targeted. We term this strategy, integrating cross-linking mass spectrometry (XL-MS) with glycoprotein surface capture, “structural surfaceomics”. As a proof of principle, we apply this technology to acute myeloid leukemia, a hematologic malignancy with dismal outcomes and no known optimal immunotherapy target. We identify the activated conformation of integrin-β2 as a structurally-defined, widely-expressed, AML-specific target. We develop and characterize recombinant antibodies to this protein conformation, and show that chimeric antigen receptor (CAR) T-cells eliminate AML cells and patient-derived xenografts without notable toxicity versus normal hematopoietic cells. Our findings validate an AML conformation-specific target antigen while demonstrating a toolkit for applying these strategies more broadly.

Abstract Mutations in receptor tyrosine kinases (RTKs) FLT3 and KIT are frequent and associated with poor outcomes in acute myeloid leukemia (AML). Although FLT3 inhibitors (FLT3i) are clinically effective, remissions are short-lived due to secondary resistance characterized by acquired mutations constitutively activating the RAS/MAPK pathway. Hereby, we report pre-clinical efficacy of co-targeting SHP2, a critical node in MAPK signaling, and BCL2 in RTK-driven AML. The allosteric SHP2 inhibitor RMC-4550 suppressed proliferation of AML cell lines with FLT3 and KIT mutations, including cell lines with acquired resistance to FLT3i. We demonstrate that SHP2 inhibition unveils an Achilles’ heel of AML, increasing apoptotic dependency on BCL2 via MAPK-dependent mechanisms, including upregulation of BMF and downregulation of MCL1. Consequently, RMC-4550 and venetoclax are synergistically lethal in FLT3 - or KIT -mutant AML cell lines, and in clinically relevant xenograft models. Our results provide new mechanistic rationale and preclinical evidence for co-targeting SHP2 and BCL2 in RTK-driven AML. Significance There is an unmet need for effective therapies targeting the MAPK pathway to overcome resistance in RTK-driven AML. We report that pharmacologic co-inhibition of SHP2 and BCL2 has synergistic anti-leukemia activity in preclinical models of AML with FLT3 and KIT mutations and holds potential clinical utility.

Renewing tissues have the remarkable ability to continually produce both proliferative progenitor and specialized differentiated cell-types. How are complex milieus of microenvironmental signals interpreted to coordinate tissue cell-type composition? Here, we develop a high-throughput approach that combines organoid technology and quantitative imaging to address this question in the context of the intestinal epithelium. Using this approach, we comprehensively survey enteroid responses to individual and paired perturbations to eight epithelial signaling pathways. We uncover culture conditions that enrich for specific cell-types, including Lgr5+ stem and enteroendocrine cells. We analyze interactions between perturbations and dissect mechanisms underlying an unexpected mutual antagonism between EGFR and IL-4 signals. Finally, we show that, across diverse perturbations, modulating proliferation of transit-amplifying cells also consistently changes the composition of differentiated secretory and absorptive cell-types. This property is conserved in vivo and can arise from differential amplification of secretory and absorptive progenitor cells. Taken together, the observations highlight an underappreciated role for transit-amplifying cells in which proliferation of these short-lived progenitors provides a lineage-based mechanism for tuning differentiated cell-type composition.

Proteasome inhibitor (PI) resistance remains a central challenge in multiple myeloma. To identify pathways mediating resistance, we first map proteasome-associated genetic co- dependencies. We identify cytosolic heat shock protein 70 (HSP70) chaperones as potential targets, consistent with proposed mechanisms of myeloma tumor cells overcoming PI-induced stress. These results lead us to explore allosteric HSP70 inhibitors (JG compounds) as myeloma therapeutics. We show these compounds exhibit increased efficacy against acquired and intrinsic PI-resistant myeloma models, unlike HSP90 inhibition. Surprisingly, shotgun and pulsed-SILAC proteomics reveal that JGs overcome PI resistance not via the expected mechanism of inhibiting cytosolic HSP70s, but instead through mitochondrial-localized HSP70, HSPA9, destabilizing the 55S mitoribosome. Analysis of myeloma patient data further supports strong effects of global proteostasis capacity, and particularly HSPA9 expression, on PI response. Our results characterize dynamics of myeloma proteostasis networks under therapeutic pressure while motivating further investigation of HSPA9 as a specific vulnerability in PI-resistant disease.### Competing Interest StatementJ.E.G. and H.S. have filed a patent related to the structures of the JG compounds. A.P.W is an equity holder and scientific advisory board member of Indapta Therapeutics and Protocol Intelligence. The other authors declare no relevant conflicts of interest.

Abstract Genetic interactions impact both normal human physiology and human diseases, such as cancer. Here, we study genetic interactions through the lens of human lung cancers driven by oncogenic forms of the epidermal growth factor receptor (EGFR), which we and others previously showed harbor a rich landscape of genetic co-alterations and potential genetic interactions. Among the most common genetic co-alterations with oncogenic EGFR are genomic amplifications of cell cycle regulators CDK4 or CDK6 , which have been implicated in EGFR inhibitor clinical resistance, although the mechanism underlying this effect is not well characterized. We show that CDK4/6 upregulation overcomes EGFR inhibitor-induced G1/S cell cycle arrest in association with increased replication stress, DNA damage and genomic instability. These biological effects arising in CDK4/6 upregulated tumors help to enable resistance to EGFR targeted therapies through established genetic resistance mechanisms. Combinatorial EGFR and CDK4/6 inhibitor treatment alleviated genomic instability and EGFR inhibitor resistance in patient-derived preclinical models. This study reveals mechanistic and clinical impacts of the genetic interaction between oncogenic EGFR and CDK4/6 co-alterations in human lung cancer.

New epitopes for immune recognition provide the basis of anticancer immunity. Due to the high concentration of extracellular adenosine triphosphate in the tumor microenvironment, we hypothesized that extracellular kinases (ectokinases) could have dysregulated activity and introduce aberrant phosphorylation sites on cell surface proteins. We engineered a cell-tethered version of the extracellular kinase CK2α, demonstrated it was active on cells under tumor-relevant conditions, and profiled its substrate scope using a chemoproteomic workflow. We then demonstrated that mice developed polyreactive antisera in response to syngeneic tumor cells that had been subjected to surface hyperphosphorylation with CK2α. Interestingly, these mice developed B cell and CD4+ T cell responses in response to these antigens but failed to develop a CD8+ T cell response. This work provides a workflow for probing the extracellular phosphoproteome and demonstrates that extracellular phosphoproteins are immunogenic even in a syngeneic system.