CXCR2 has been suggested to have both tumor-promoting and tumor-suppressive properties. Here we show that CXCR2 signaling is upregulated in human pancreatic cancer, predominantly in neutrophil/myeloid-derived suppressor cells, but rarely in tumor cells. Genetic ablation or inhibition of CXCR2 abrogated metastasis, but only inhibition slowed tumorigenesis. Depletion of neutrophils/myeloid-derived suppressor cells also suppressed metastasis suggesting a key role for CXCR2 in establishing and maintaining the metastatic niche. Importantly, loss or inhibition of CXCR2 improved T cell entry, and combined inhibition of CXCR2 and PD1 in mice with established disease significantly extended survival. We show that CXCR2 signaling in the myeloid compartment can promote pancreatic tumorigenesis and is required for pancreatic cancer metastasis, making it an excellent therapeutic target.

It is now well established that tumours undergo changes in cellular metabolism1. As this can reveal tumour cell vulnerabilities and because many tumours exhibit enhanced glucose uptake2, we have been interested in how tumour cells respond to different forms of sugar. Here we report that the monosaccharide mannose causes growth retardation in several tumour types in vitro, and enhances cell death in response to major forms of chemotherapy. We then show that these effects also occur in vivo in mice following the oral administration of mannose, without significantly affecting the weight and health of the animals. Mechanistically, mannose is taken up by the same transporter(s) as glucose3 but accumulates as mannose-6-phosphate in cells, and this impairs the further metabolism of glucose in glycolysis, the tricarboxylic acid cycle, the pentose phosphate pathway and glycan synthesis. As a result, the administration of mannose in combination with conventional chemotherapy affects levels of anti-apoptotic proteins of the Bcl-2 family, leading to sensitization to cell death. Finally we show that susceptibility to mannose is dependent on the levels of phosphomannose isomerase (PMI). Cells with low levels of PMI are sensitive to mannose, whereas cells with high levels are resistant, but can be made sensitive by RNA-interference-mediated depletion of the enzyme. In addition, we use tissue microarrays to show that PMI levels also vary greatly between different patients and different tumour types, indicating that PMI levels could be used as a biomarker to direct the successful administration of mannose. We consider that the administration of mannose could be a simple, safe and selective therapy in the treatment of cancer, and could be applicable to multiple tumour types. Mannose reduces the growth of tumour cells by impairing the metabolism of glucose, and enhances cell death when used in combination with conventional chemotherapy.

Summary

 The metastatic process of colorectal cancer (CRC) is not fully understood and effective therapies are lacking. We show that activation of NOTCH1 signaling in the murine intestinal epithelium leads to highly penetrant metastasis (100% metastasis; with >80% liver metastases) in Kras^G12D-driven serrated cancer. Transcriptional profiling reveals that epithelial NOTCH1 signaling creates a tumor microenvironment (TME) reminiscent of poorly prognostic human CRC subtypes (CMS4 and CRIS-B), and drives metastasis through transforming growth factor (TGF) β-dependent neutrophil recruitment. Importantly, inhibition of this recruitment with clinically relevant therapeutic agents blocks metastasis. We propose that NOTCH1 signaling is key to CRC progression and should be exploited clinically.

Here we show that Rab25 permits the sorting of ligand-occupied, active-conformation α5β1 integrin to late endosomes/lysosomes. Photoactivation and biochemical approaches show that lysosomally targeted integrins are not degraded but are retrogradely transported and recycled to the plasma membrane at the back of invading cells. This requires CLIC3, a protein upregulated in Rab25-expressing cells and tumors, which colocalizes with active α5β1 in late endosomes/lysosomes. CLIC3 is necessary for release of the cell rear during migration on 3D matrices and is required for invasion and maintenance of active Src signaling in organotypic microenvironments. CLIC3 expression predicts lymph node metastasis and poor prognosis in operable cases of pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC). The identification of CLIC3 as a regulator of a recycling pathway and as an independent prognostic indicator in PDAC highlights the importance of active integrin trafficking as a potential drive to cancer progression in vivo.

Plasmax, a physiological cell culture medium, prevents metabolic artifacts imposed on cancer cells by commonly used media.

Genetically encoded probes are widely used to visualize cellular processes in vitro and in vivo. Although effective in cultured cells, fluorescent protein tags and reporters are suboptimal in vivo because of poor tissue penetration and high background signal. Luciferase reporters offer improved signal-to-noise ratios but require injections of luciferin that can lead to variable responses and that limit the number and timing of data points that can be gathered. Such issues in studying the critical transcription factor p53 have limited insight on its activity in vivo during development and tissue injury responses. Here, by linking the expression of the near-infrared fluorescent protein iRFP713 to a synthetic p53-responsive promoter, we generated a knock-in reporter mouse that enabled noninvasive, longitudinal analysis of p53 activity in vivo in response to various stimuli. In the developing embryo, this model revealed the timing and localization of p53 activation. In adult mice, the model monitored p53 activation in response to irradiation and paracetamol- or CCl 4 -induced liver regeneration. After irradiation, we observed potent and sustained activation of p53 in the liver, which limited the production of reactive oxygen species (ROS) and promoted DNA damage resolution. We propose that this new reporter may be used to further advance our understanding of various physiological and pathophysiological p53 responses.

Abstract IDH wild-type glioblastoma (GBM) is the most prevalent malignant primary brain tumour in adults. GBM typically has a poor prognosis, mainly due to a lack of effective treatment options leading to tumour persistence or recurrence. Tackling this, we investigated the therapeutic potential of targeting anti-apoptotic BCL-2 proteins in GBM. Levels of anti- apoptotic BCL-xL and MCL-1 were consistently increased in GBM compared with non- malignant cells and tissue. Moreover, we found that relative to their differentiated counterparts, patient-derived GBM stem-like cells also displayed higher expression of anti- apoptotic BCL-2 family members. Surprisingly, high anti-apoptotic BCL-xL and MCL-1 expression correlated with heightened susceptibility of GBM to BCL-2 family protein- targeting BH3-mimetics. This is indicative of increased apoptotic priming. Indeed, GBM displayed an obligate requirement for MCL-1 expression in both tumour development and maintenance. Investigating this apoptotic sensitivity, we found that sequential inhibition of BCL-xL and MCL-1 led to robust anti-tumour responses in vivo , in the absence of overt toxicity. These data demonstrate that BCL-xL and MCL-1 pro-survival function is a fundamental prerequisite for GBM survival that can be therapeutically exploited by BH3- mimetics.

Abstract Objective Hepatocellular carcinoma (HCC) is increasingly associated with non-alcoholic steatohepatitis (NASH). HCC immunotherapy offers great promise; however, recent data suggests NASH-HCC may be less sensitive to conventional immune checkpoint inhibition (ICI). We hypothesised that targeting neutrophils using a CXCR2 small molecule inhibitor may sensitise NASH-HCC to ICI therapy. Design Neutrophil infiltration was characterised in human HCC and mouse models of HCC. Late-stage intervention with anti-PD1 and/or a CXCR2 inhibitor was performed in murine models of NASH-HCC. The tumour immune microenvironment was characterised by imaging mass cytometry, RNA-seq and flow cytometry. Results Neutrophils expressing CXCR2, a receptor crucial to neutrophil recruitment in acute-injury, are highly represented in human NASH-HCC. In models of NASH-HCC lacking response to ICI, the combination of a CXCR2 antagonist with anti-PD1 suppressed tumour burden and extended survival. Combination therapy increased intratumoral XCR1 + dendritic cell activation and CD8 + T cell numbers which are associated with anti-tumoral immunity, this was confirmed by loss of therapeutic effect upon genetic impairment of myeloid cell recruitment, neutralisation of the XCR1-ligand XCL1 or depletion of CD8 + T cells. Therapeutic benefit was accompanied by an unexpected increase in tumour-associated neutrophils (TANs) which switched from a pro-tumor to anti-tumour progenitor-like neutrophil phenotype. Reprogrammed TANs were found in direct contact with CD8 + T cells in clusters that were enriched for the cytotoxic anti-tumoural protease granzyme B. Neutrophil reprogramming was not observed in the circulation indicative of the combination therapy selectively influencing TANs. Conclusion CXCR2-inhibition induces reprogramming of the tumour immune microenvironment that promotes ICI in NASH-HCC. Significance of this study What is already known on this subject? Immune checkpoint inhibition therapy is emerging as a promising new therapy for the treatment of advanced hepatocellular carcinoma (HCC). Only a minority of HCC patients will respond to immune checkpoint inhibition (ICI) therapy and recent data suggest that HCC on the background of NASH may have reduced sensitivity to this treatment strategy. Neutrophils are a typical myeloid component of the liver in NASH and are found either within the HCC tumour microenvironment or in a peritumoural location. Neutrophils have considerable phenotypic plasticity and can exist in both tumour promoting and tumour suppressing states. Neutrophils may have the ability to influence ICI therapy. What are the new findings? CXCR2 + neutrophils are found in human NASH and within the tumour of both human and mouse models of NASH-HCC. The resistance of NASH-HCC to anti-PD1 therapy is overcome by co-treatment with a CXCR2 small molecule inhibitor, with evidence of reduced tumour burden and extended survival. Anti-PD1 and CXCR2 inhibitor combine to selectively reprogramme tumour-associated neutrophils (TANs) from a pro- to an anti-tumour phenotype. Reprogrammed TANs proliferate locally within Granzyme B + immune clusters that contain physically associating CD8 + T cells and antigen presenting cells. Conventional XCR1 + dendritic cells (cDC1s) are found to be elevated in anti-PD1 and CXCR2 inhibitor treated HCCs and together with CD8 + T cells are required for therapeutic benefit. How might it impact on clinical practice in the foreseeable future? TANs can be selectively manipulated to adopt an anti-tumour phenotype which unlocks their potential for cancer therapy. The ability of CXCR2 antagonism to combine with ICI therapy to bring about enhanced therapeutic benefit in NASH-HCC (and potentially in HCC of other aetiologies) warrents clinical investigation.

Abstract Mice are a widely used pre-clinical model system in large part due to their potential for genetic manipulation. The ability to manipulate gene expression in specific cells under temporal control is a powerful experimental tool. The liver is central to metabolic homeostasis and a site of many diseases, making the targeting of hepatocytes attractive. Adeno-Associated Virus 8 (AAV8) vectors are valuable instruments for the manipulation of hepatocellular gene expression. However, their off-target effects in mice have not been thoroughly explored. Here, we sought to identify the short-term off-target effects of AAV8 administration in mice. To do this, we injected C57BL/6J Wild-Type mice with either recombinant AAV8 vectors expressing Cre recombinase or empty AAV8 vectors and characterised the changes in general health and in liver physiology, histology and transcriptomics compared to uninjected controls over 1 week. We observed an acute and transient reduction in homeostatic liver proliferation together with induction of the DNA damage marker γH2AX following AAV8 administration. The latter was enhanced upon Cre recombinase expression by the vector. Furthermore, we observed transcriptional changes in genes involved in circadian rhythm and response to infection. Notably, there were no additional transcriptomic changes upon expression of Cre recombinase by the AAV8 vector. Overall, there was no evidence of liver injury, dysfunction or leukocyte infiltration following AAV8 infection. These data support the use of AAV8-based Cre recombinase delivery as a specific tool for hepatocellular gene manipulation with minimal effects on murine physiology but highlight the off target effects of these systems. Summary statement This paper provides a comprehensive characterisation of the short-term effects of administration of Adeno-Associated Virus 8 on murine physiology, liver histology and liver transcriptome.